酵母双杂交PPT课件PPT资料.pptx

1、最近兴起的双杂交系统为研究蛋白质的相互 作用提供了一套崭新的方法。,酵母双杂交系统的基本原理,A,The DNA-BD/protein X（bait）hybrid binds to the GAL1 UAS but cannot activate transcription without the activation domain（AD）.,In the absence of bait protein,the AD/library fusion protein cannot bind to the GAL 4 UAS and thus does not activate transcript

2、ion.,B,Interaction between the bait and library proteins in vivo a activates transcription of The reporter gene.,C,构建诱饵蛋白质粒（BD质粒）检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录（如果不能，继续）文库质粒（AD质粒）转化带有BD质粒的酵母菌，铺SD/四缺平板挑his+、ade+双阳性克隆作-galactosidase分析，消除假阳性-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒检查AD质粒单独是否能激活

3、报告基因转录（如果不能，继续）AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询,如果找到候选蛋白，克隆其 全基因，采用GST融合表达技术和体外翻译技术在蛋白,如果找不到候选蛋白，有可能 是新基因，可进一步分析，设计引物，克隆全基因并进一步验证,基因在真核细胞中的表达及定位分析图三 双杂交系统文库筛选过程流程图,图1 双杂交系统工作原理示意图Fig.1 Model of transcriptional activation by reconstitution of Gal4 activity天然Gal4蛋白具有DNA结合域和转录激活域，诱

4、导Gal1-LacZ转录；只有DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录；蛋白X和Y之间的相互作用使Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录the native Gal4 protein contains both DNA-binding and activating regions and induces Gal1-LacZ transcription;hybrids containing either DB（upper）or AD（lower）are incapable of inducing transcription;a protein-protein in

5、teraction between proteins X and Y brings the Gal4 domains into closes proximity and results in transcriptional activity,双杂交系统是由Fields和Song于1989年提出的1。它的建立是基于对真核生物掉空转录起始过程的认识，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子 的参与。转录激活因子，例如酵母转录因子Gal4，在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain）构成。其中有DNA结合结构域（DNA bonding

6、 domain,DNA-BD）和转录激活 结构域（activation domain,DNA-AD。这两个结合域将它们分开时仍分别具 有功能，但是不能激活转录，只有当两者通过适当的途径在空间上较为接近 时，才呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（uostreamactivating sequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。,天然Gal4分子由一条多肽链组成，含881个氨基酸。它有两个结构域：DNA结合域（DNA-binding domain,DB），由位 于N-末端的1147个氨基酸构成，能够识别位于Gal1 基因的 上游激活序列（upstream activ

7、ating sequence，UAS），此外，在其N-端还具有一段核定位序列；转录激活域（DNA-activating,AD），由位于C-末端的768881位氨基酸构成。当 Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分 接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。,Fields等以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型设计了一个新的检测蛋白-蛋白相互作用的系统。将Snf1与DB融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其 中，Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一个结合蛋白。研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株，该菌株含有La

8、cZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空 间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。,图2普通双杂交系统的组成示意图,一般地，将DB-X的融合蛋白称作诱饵（bait），X 往往是已 知蛋白；AD-Y称作猎 物（prey），Y称作猎 物；整个实验过程称作“狩猎”（hunt或fish）,双杂交系统的发展,报告基因的多样化诱饵表达载体猎物表达载体,除了LacZ外，还利用了酵母的营养缺陷型，如Leu2和His3。此外，还发展了双报告基因系统。即 未知蛋白Y与两个不同的AD融合，分别引起两个报 告基因的转录。这样，实验结果的可靠性增大，敏 感性

9、增强。报告基因以多拷贝质粒的形式存在，或 整合入酵母基因组中。,报告基因的多样化,在MATCHMAKER Two-Hybrid Systerm 3中首次采用his3、ade2和lacZ三个报告基因，并采用三个不同的启动子，大大降低了假阳性的出现率,图3,双报告基因系统,常用的有两种：Gal4 和来自 E.coli 的LexA，它结合于LexA 操纵子上。二者的差别在于LexA不 具有核定位序列。,诱饵表达载体,猎物表达载体,VP16 来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于其他两个；酵母Gal4 的转录激活域；B42 来自 E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达对细 胞的影响，

10、并且在B42 后有流感病毒HA 抗原，易于将蛋白分离纯化,THANKYOU,SUCCESS,2019/6/26,针对非核内蛋白质,在酵母双杂交系统中，BD-X和AD-Y在酵母细胞核内发生相互作用，表达的融合蛋白需要定向到核内来激活报告基因的转录，这就可能限制了大量非核内蛋白质，如 膜蛋白，分泌蛋白，膜受体及胞质蛋白等在此系统中的应用。针对这个问题，发展了其它方法。SOS恢复系统（sos recruitment system,SRS）是针对于膜受体，细胞外分泌蛋白的一种方法。酵母的温度敏感株，ras途径突变体，由于缺乏鸟苷酸交换因子（guanyl nucleotide exchange fact

11、or,GEF）cdc25-2，所以不 能将外来信号传递给膜上的RAS蛋白，致使酵母突变体在 36不能存活。如果引入 正常SOS蛋白，使SOS蛋白与RAS接近则可以使细胞存活。Arpnheim等将GEF蛋白（SOS蛋白）与X融合，蛋白Y与豆蔻酰化信号融合，使 Y定位于膜上。这样，若X 与Y结合，则X连同的SOS蛋白就会定位于膜上而靠近膜上的RAS蛋白，激活ras途径，完成SOS过程，能在36下生长（图10）。这一系统的建立冲破了许多的局限。,图10SOS恢复系统,Fig.10,SOS recruitment system,三杂交系统两个蛋白之间通过第三者发生相互作用。第三物可以是蛋白质、小分子或

12、RNA。,三杂交系统,依赖于蛋白质的三杂交系统,蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用；蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用；蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用protein Z stabilizes the interaction of A and B;Z contacts A and B with different surfaces;Z modifies A and dissociates.Modified A then contacts B图5蛋白质三杂交系统Fig.5 protein-dependent three-hybrid system.,通过小分子（配体）相互作用的三杂交系统（图6）

13、，小分子与其受体的相互作用不仅是许多生物学过程的基础，而且在医学领域有重要的价值。,通过小分子（配体）相互作用的三杂交系统,图6 通过小分子的三杂交系统Fig.6 small ligands-dependent three-hybrid system Glucoroticoid 地塞米松;Glucoroticoid receptor 糖皮质激素受体,Licitra等利用FK506与地,塞米松杂合分子，将与LexA-BD融合的糖皮质激素受体及 杂合分子作为诱饵，用于筛 选与AD融合的Jurkat cDNA 文库，分离了与FK506结合 的蛋白FKBP1211。,通过RNA的三杂交系统（图7），R

14、NA 与蛋白质的相互作用是某些生命活动的基础，如转录、mRNA的剪切及RNA 病毒与宿主之间的作用等。Wichens 等提出了分析RNA 与蛋 白相互作用的方法,通过RNA的三杂交系统,图7 RNA介导的三杂交系统Fig.7 RNA-dependent three-hybrid system,RNA binding domain 1 RNA binding domain 2,：RNA 结合域1;：RNA 结合域2;,Hybrid RNA：RNA杂合分子,在这个系统中，与AD融合的蛋 白是一个具有RNA结合域的蛋白（如 细菌MS2），能够与RNA分子的臂-环结构结合；RNA除具有臂-环结构 外，

15、还有诱饵序列（test）。这样 RNA分子与DB-蛋白复合物构成了双 杂交系统中的诱饵，它结合于报告基 因的上游；第3个分子是AD-蛋白，如 果该蛋白识别诱饵序列test并结合，则报告基因转录。该系统用于确定识别目的RNA的 蛋白质的RNA结合域，也可以研究被 已知蛋白质识别的RNA序列。利用这 个系统成功地发现了许多RNA与蛋白 质之间的相互作用。包括铁离子调节 蛋白与铁反应元件的结合12；HIV 翻译激活因子Tat与Tar反应元件RNA 序列的结合等,Vidal等提出的负选择系统用于研究相互作用的蛋白间的结构特征，筛选蛋白突变体，也可用于确定能够打破特异的蛋白相 互作用的试剂。其原理在于BD-X/AD-Y激活的报告基因转录在 特定的条件下是有毒性的，而相互作用的解除提供了可选择性。表达URA3基因的酵母在缺乏5-氟乳清酸的培