化验技术协会第七期培训资料2Word下载.docx

1、凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。 填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在l5nm（1nml0）以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH28的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高

2、表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。 （2）检测器 最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD），荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关，示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，蒸发光散射检测器对

3、结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外可见分光光度法项下对溶剂的要求，采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。（3）

4、波动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷健合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。2系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子

5、等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。（1）色谱柱的理论板数（n） 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2），按n5.54（tRWh2）2计算色谱柱的理论板数。（2）分离度（R） 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式

6、为：2（tR2-tR1）R=W1+W2式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2为此相邻两峰的峰宽。除另有规定外，定量分析时分离度应大于1.5。（3）重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0。（4）拖尾因子（T） 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为

7、：W0.05hT=2d1W0.05h为5峰高处的峰宽；d1为峰顶点至峰前沿之间的距离除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。3测定法（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： As/Cs校正因子（）=： AR/CRAs为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；Cs为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度

8、。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量； AX含量（Cx）= As/Cs式中Ax为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；Cx为供试品（或其杂质）的浓度；As为内标物质的峰面积或峰高；Cs为内标物质的浓度；为校正因子。当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，CsCs，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。（2）外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对

9、照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：含量（cx）=cR AR式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。（3）加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值一

10、并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的1025或其峰面积能准确积分通常含量低于0.5的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10；含量在0.5一2的杂质，峰面积的RSD应小于5；含量大于2的杂质，峰面积的RSD应小于2。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶

11、液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。（4）不加校正因子的主成分自身对照法当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂的色谱图。色谱图I上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。（5）面积归一化法由于峰

12、面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积及其之和占总峰面积的百分率。中国药品检验标准操作规范 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分

13、离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基键合硅胶（又称ODS），可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长的紫外可见光检测器，其他的检测器有二极管阵列紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器

14、等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实现程序控制。 现将检测器分述如下： 1.1 紫外检测器（Ultraviolet detector，UV） 紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的检测器，几乎所有的液相色谱仪都配此类检测器，是一种选择性检测器。 工作原理：朗伯比尔（LambertBeer）定律，即当一束单色光透过样品池时，若流动相不吸收光，则吸光度（A）与吸光组分的浓度（C）和样品池的光径长度（L）成正比。 分类：紫外检测器包括固定波长检测器，可变波长检测器和光电二极管阵列检测器三类。 固定波长检测器的波长一般为254nm，以低压汞灯为光源，光源单色性好、光强度大、灵敏度高，适合于大多数芳香族、芳杂环、稠芳环类以及芳香氨基酸、核酸等的检测。 可变波长检测器是目前配置最多的检测器。光路系统类似分光光度计，一般采用氘灯或卤钨灯为光源，光束经单色器分光后按需要选择组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。有的还