生物科技行业微生物限度检查法Word文档格式.docx

1、检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或 cm2 ）。除另有规定外，一般供试品的检验量为 10g 或 10ml；膜剂为 100 cm2；贵重药品、 微量包装药品的检验量可以酌减。 要求检查沙门菌的供试品， 其检验量应增加 20g 或 20ml（其中 10g或10ml 用于阳性对照试验）。 检验时，应从 2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于 4丸，膜剂还不得少于 4 片。 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的 3 倍量供试品。 供试品溶液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性， 采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超

2、过 45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 1 小时。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品 10ml，加 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，混匀，作为110 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯 80 使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品 10g， 加 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml， 用匀浆仪或其 他适宜的方法， 混匀， 作为 110 的供试液。 必要时加适量的无菌聚山梨酯 80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊方法制备供试液

3、的供试品 （1）非水溶性供试品 方法 1 取供试品 5g（或 5ml）， 加至含溶化的（温度不超过 45） 5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入 45的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为 120 的供试液。 方法 2 取供试品 10g， 加至含 20ml 无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录 B 无菌检查法中供试品的无菌检查项下） 和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。 然后加入 45的 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100

4、ml，振摇 510 分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为 110 的供试液。 （2）膜剂供试品 取供试品 100cm2 ，剪碎，加 100ml 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为 110 的供试液。 （3）肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品 10g， 加 pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂） 或 pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂） 至 100ml， 置 45水浴中， 振摇， 使溶解， 作为 110 的供试液。 （4）气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品， 置冰冻室冷冻约 1 小时， 取出， 迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢

5、锥在该部位钻一小孔， 放至室温， 并轻轻转动容器， 使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲 液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯 80）中，混匀，取相当于 10g或 10ml 的供试品，再稀释成 110 的供试液。 （5）贴膏剂供试品 取规定量供试品， 去掉贴膏剂的保护层， 放置在无菌玻璃或塑料片上， 粘贴面朝上。 用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布） 覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯 80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少 30 分钟，制成供试液。贴膏剂也可以其他适宜的方法制

6、备成供试液。 （6）具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时， 采用下列方法进行处理， 以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。 培养基稀释法 取规定量的供试液， 至较大量的培养基中， 使单位体积内的供试品含量减少， 至不含抑菌作用。 测定细菌、 霉菌及酵母菌的菌数时， 取同稀释级的供试液 2ml， 每 1ml 供试液可等量分注多个平皿， 倾注琼脂培养基， 混匀，凝固，培养，计数。每 1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为 1ml的菌落数， 计算每 1ml 供试液的平均菌落数， 按平皿法计数规则报告菌数； 控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 离心沉淀法 取一定量的供试液，

7、 500 转/分离心 3 分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。 薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。 中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。 细菌、霉菌及酵母菌计数 计数培养基的适用性检查 细菌、 霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查， 成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代）。并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌

8、（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003 菌液制备 接种大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养 1824 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养 2448 小时

9、。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 57 天，加入 35ml 含 0.05（ml/ml） 聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。 然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内， 用含 0.05（ml/ml） 聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用， 若保存在 28可在 24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。 适用性检查 取大肠埃

10、希菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌各 50100cfu，分别注入无菌平皿中， 立即倾注营养琼脂培养基， 每株试验菌平行制备 2 个平皿，混匀， 凝固， 置 3035培养48 小时， 计数； 取白色念珠菌、黑曲霉各 50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2个平皿， 混匀， 凝固， 置 2328培养 72 小时， 计数； 取白色念珠菌 50100cfu，注入无菌平皿中， 立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基， 平行制备 2 个平皿，混匀， 凝固， 置 2328培养 72 小时， 计数。 同时， 用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果

11、判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的 70%， 且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。 判该培养基的适用性检查符合规定。 计数方法的验证 当建立产品的微生物限度检查法时， 应进行细菌、 霉菌及酵母菌计数方法的 验证， 以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、 霉菌及酵母菌数的测定。 若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。 验证时， 按供试液的制备和细菌、 霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 菌种及菌液制备 同计数培养基的适用性检查 验证方法 验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分

12、别计算各试验菌每次试验的回收率。 （1） 试验组 平皿法计数时， 取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 和 50100cfu 试验菌， 分别注入平皿中， 立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备 2个平皿， 按平皿法测定其菌数。 薄膜过滤法计数时， 取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入 50100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 （2）菌液组 测定所加的试验菌数。 （3）供试品对照组 取规定量供试液， 按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时， 应增加稀释剂对照组，

13、 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时， 可用相应的稀释液替代供试品， 加入试验菌， 使最终菌浓度为每1ml 供试液含 50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 结果判断 在 3 次独立的平行试验中， 稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70%。若试验组的菌数回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于 70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄

14、膜过滤法、中和法（常见干扰物的中和剂或灭活方法见表 1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。表 1 常见干扰物的中和剂或灭活方法 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛 亚硫酸氢纳 酚类、乙醇、吸附物 稀释法 醛类 稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（QACs）、 卵磷脂、聚山梨酯 对羟基苯甲酸酯汞类制剂 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰类 聚山梨酯 卤化物 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（EDTA） 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 -内酰胺类抗生素 -内酰胺酶 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。 但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用， 而对其他菌株没有抑制作用。 因此， 根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则， 在不影响检验结果判断的前提下， 应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试