WB试验基本步骤Word文档下载推荐.docx

1、磷酸二氢钾 0. 24g磷酸氢二钠 1 - 44g氯化钠 8g氯化钾 0.2g加入500ml纯水，调PH=7. 2定容至1L.高压蒸汽灭菌2.PBST （PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0. 25ml 吐温-203 电转液500mlTris 1 5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4C冰箱预冷4电泳液（1X）10x稀释，50ml 10x电泳液+450ml纯水5.TBS6.TBST （TBS+0.05%吐温-20）50mlTBS+450ml 纯水+0.25ml 吐温-207 封闭液TBST1X+5% 奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40 C

2、预热WB实验一、蛋白样品制备准备:一管细胞，PBS （4C预冷），PMSF （lOOmM）,移液枪（lOOOuL 10ul） , 1.5mlEP管2个，高速冷冻 离心机4C预冷1.于-20C冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入lml 4C预冷的PBS （0.01M pH7.27.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4C , 8000r离心5min,然后 弃去上淸。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。3.按lml裂解液加10 UIPMSF （lOOmM）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min

3、,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回 摇动。5.裂解完后,于4C b 12000 rpm离心5 min。7.将离心后的上淸分装转移倒0.5 ml的离心管中放于一20C保存。二、蛋白含量的测定（BCA定量）准备：96 孔板，移液枪（lOOOul, 10ul, 200ul） , BCA 工作液（A+B） , 50mlEP 管，lxPBS, BSA 标准液1将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B） , （A液：B液=50:1, 一般配多些，如60孔，A液12000ul,B 液 240ul）3.将样品稀释到一定倍数才能

4、定量,（10倍，20倍,30倍），每孔需要20ul样品（2样品+18ulPBS,即稀 释10倍），做三个重复则需要60ul, 般配80ul4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml,若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则 需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0, l,2,4,8,12;16,20ul加到标号的区域，之后 在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul&每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差7.将加好的96孔板放在37C下孵弃30分钟

5、8.孵弃完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s冲速,吸光值595nm,进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后, 以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。（r20.98才有用，酶标仪操作:两个箭头图标,1是 结果,2是保存）9|算蛋白含量（注意左量样品已经稀释了 10倍）蛋白质定量标准曲线加样量序号 12345678标准蛋白量/ul（0. 5mg/ml）背景液（PBS） /ul 2三、SDS-PAGE电泳1.配胶（12%,可以提前配好）玻璃板，梳子，AP （解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4C冰箱冷藏）（1） 玻璃板验漏5min（2） 按表配置分离胶（3） 灌胶，加酒精封压，凝30

6、min （注意不要有气泡）（4） 按表配浓缩胶，倒掉洒精，用吸水纸吸去洒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min（5） 取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4C冰箱保存备用2.样品处理PBS,移液枪，1.5mlEP管（1） 稀释样品：一般每孔上样5ul,即lmg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至lmg/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）（2） 取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中，加入6XSDS上样缓冲液3ul至终浓度为IX。（上样总体积 一般不超过15 Pl,加样孔的最大限度可加20 ,样品。（3） 将样品在100C煮5min

7、震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）3.电泳电泳液500ml （现配），蛋白胶，20ul移液枪（枪头），样品，Marker,冰盒，电泳装置（1）将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板而向内，长玻璃板面向外。若只跑一块 胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一而面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。（2）上样。用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸岀不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔.若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。（3）先设置80V,开始电泳，样品渙酚蓝跑至分离胶

8、后增至120V电压，电泳至渙酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（此时准备好电转液）四、电转液（现配4C冰箱冷藏），很子，滤纸，PVDF膜（0.45um）,电转装置，冰盒注意：拿滤纸和膜时一过要戴手套或用银子，因为手上的蛋白会污染膜。1.在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫2.滤纸浸入电转液中，PVDF膜任甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4C电转液中平衡至少5min。3.将夹子打开使黑的一而保持水平。在上而垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一 手擀另一手要压住垫子使苴不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上）， 一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的

9、气泡。4.先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松 动，直到撬去玻板。（撬时一左要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影 响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐， 轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤 纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去 气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开 门以使空气流通。5.将夹子放

10、入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白而对槽的 红而。一般用100mA转移90min；6.转完后将膜用IX丽春红染液染5 min （于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上 的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）六、免疫反应封闭液，一抗，二抗，TBST1.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。2.TBST洗4次。每次5分钟。3.将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h或者4C过夜4.室温下孵冇12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min5.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵ffl2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每次 5 min七、显影样品胶片，移液枪（200ul）,中枪头，吸水纸，显影液（A+B）,薄银子一抗目的蛋白78kdBip 1:1000兔二抗目的蛋白34kdGAPDH 内参 1:5000鼠二抗28kd目的蛋白17kdSepl5 1:2将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;2.1 min后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用银子夹起来正反而充分和显影液接触，注意切角在左上, 即正而朝上。应注意的是：显影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。3盖上盖子，将胶片进行扫描或扌白照。