拟穴青蟹不同种群线粒体功能和代谢酶活性低温季节的纬度差异Word文档格式.docx

1、南、北种群肌肉的乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶和己糖激酶活性比较结果显示，宁波海域北方种群的己糖激酶活性显著高于该海域的南方种群。上述结果表明，分布于我国东南沿海的拟穴青蟹其北方种群比南方种群对温度有更有效的代谢补偿能力，且纬度越高，二者的差异越显著，由此可见分布于我国东南沿海的拟穴青蟹其北方种群比南方种群更能适应低温环境。关键词：拟穴青蟹；种群；线粒体呼吸率；酶活性；纬度差异中图分类号： P735 文献标志码：A青蟹隶属于甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）梭子蟹科（Portunidae）青蟹属（Scylla），一般认为青蟹属有四个种，主要分布于暖温带和热带海域。形态学、12S r

2、RNA、16S rRNA和COI基因序列分析结果表明，我国沿海的青蟹其优势种为拟穴青蟹（Scylla paramamosain）主要分布于我国长江口以南的东南沿岸水域，是一种重要的经济蟹类1-8。我国拟穴青蟹养殖规模较大，相关的研究也较多9，但其种群生物学的研究较少10。本课题组曾从形态学、生理学和遗传学等方面对拟穴青蟹种群生物学进行了一些研究，结果表明：分布于我国沿海的拟穴青蟹可能已分化为南、北两个种群，且南、北种群的个体混杂分布于我国不同海域，随纬度变化同一海域不同种群所占的比例不同。北方种群的个体主要分布于纬度较高的江浙沿岸海域，纬度越低其数量越少；南方种群的个体则主要分布于纬度较低的海

3、南岛和北部湾沿岸海域，纬度越高其个体数量越少。两个种群适应环境温度的能力不同，北方种群比南方种群更能适应低温环境，在高温环境下则是南方种群生长得更好10-12。最近，本课题组分析了分布在我国不同海域的拟穴青蟹其线粒体呼吸率和代谢酶活性的季节变化，发现分布在我国北方海域的拟穴青蟹其线粒体呼吸率和细胞色素C氧化酶（CCO）活性明显高于分布在我国南方海域的个体，说明分布于我国北方海域的拟穴青蟹比分布在我国南方海域的拟穴青蟹更能适应低温环境12，这个结果进一步支持了分布在我国沿海的拟穴青蟹可能已分化为南、北两个不同的种群的观点。前已述及，拟穴青蟹南、北种群的个体是混杂分布于我国不同海域，随纬度变化同一

4、海域不同种群所占的比例不同。为了进一步查明分布在我国不同海域的北方种群是不是也比分布在我国不同海域的南方种群更能适应低温环境，本研究在我国东南沿海不同纬度的海域采集低温季节的拟穴青蟹野生样品来比较其南、北种群的线粒体呼吸率和CCO、乳酸脱氢酶（LDH）、丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）活性的差异，采样的海域分别为浙江省的宁波、福建省的漳州和海南省的儋州，期望通过分析比较能进一步了解分布于我国沿海的拟穴青蟹其种群的分化情况、不同种群的分布规律及其生理特征，为我国拟穴青蟹种质资源的开发和保护以及水产养殖的生产和管理提供理论依据。1 材料与方法1.1 拟穴青蟹样品采集与处理在我国热带、亚热带海域

5、采集低温季节的野生拟穴青蟹，采样的海域分别为浙江省的宁波（纬度约为2914）、福建省的漳州（2379）和海南省的儋州（1969），采样时间分别为2010年11月、2010年12月和2011年1月。采集到的拟穴青蟹活体运回实验室，按照本课题组确立的鉴定方法12进行分类鉴定以筛选出南、北种群的典型个体。拟穴青蟹南方种群的个体其螯足腕节外缘有2根刺，其中1根刺极小；北方种群的个体其螯足腕节外缘只有1根发达的刺。选取处于同一发育阶段、肢体完整健康的个体暂养在实验室中2天以让应试动物恢复到正常的生理状态。每个采样点的每个种群选取6只个体用于线粒体呼吸速率的测定和相关酶活性分析。每只拟穴青蟹养在一个120

6、 L的培养箱中，内含100 L过滤海水，海水的温度和盐度与采样点海水的温度和盐度一致，培养期间连续充气，每天投喂适量的合适饵料。采样时采样点海水的温度和盐度、各种群个体的壳宽平均值和性别比例见表1。表1 采样时采样点海水的温盐度及样品的生物学参数Tab. 1 The water temperature and salinity of the sampling site and biological parameters of specimens采样点采样时水温/采样点盐度壳宽（平均值标准差）/cm雌雄比例北方种群南方种群宁波161928.18.66 0.338.50 0.581:1漳州1517

7、27.38.95 8.85 2:儋州192122.38.45 0.218.40 0.421.2 线粒体提取及其蛋白质含量测定提取线粒体时，将暂养在实验室的拟穴青蟹经24 h饥饿处理后，剪开其头胸甲取出鳃、肝胰腺和附肢肌肉，其中两只螯足放于70 超低温冰箱中保存以备酶活分析之用。按照Liu等12的方法提取鳃、肝胰腺和肌肉的线粒体。采用BCA法13测定线粒体制备液的蛋白质含量。在蛋白质含量测定之前，将10 L的线粒体制备液溶解于1 mL无牛血清蛋白（BSA）的提取缓冲液中，在12 000 g、4 条件下离心10 min，沉淀之后再次经两次的溶解和离心以去除BSA对总蛋白测定的影响14。1.3 线粒

8、体呼吸速率测定使用氧电极测定线粒体呼吸速率，测定温度为25 ，三种组织的测定方法一致，均采用经改良的Hulbert等15的方法。首先往反应室中加入1.98 mL 呼吸缓冲液（100 mmol/L KCl，40 mmol/L Sucrose，5 mmol/L Hepes，10 mmol/L K2HPO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，0.5% BSA，pH = 7.2），接着加入50 L的线粒体制备液，待基线平稳后，线粒体耗氧率几近于零，此时为线粒体的状态1呼吸速率；加入10 L 琥珀酸（终浓度为2 mmol/L）或者10 L 的丙酮酸+苹果酸（二者的终浓度为5 mm

9、ol/L），此时测得的耗氧率为线粒体状态2呼吸速率；然后加入10 L ADP（终浓度为0.2 mmol/L），此后耗氧率会显著地上升，为线粒体状态3呼吸速率，即线粒体最大耗氧率；此状态持续一段时间后，耗氧率随着ADP的消耗而逐渐下降，ADP耗尽后的耗氧率则为状态4呼吸速率。线粒体呼吸速率的单位表示为每分钟每毫克线粒体蛋白质消耗的纳摩尔氧。1.4 线粒体CCO分析在CCO活性测定前，将肝胰腺、鳃和肌肉的线粒体制备液稀释于低渗的氯化钾溶液（10 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris，pH = 7.6），经冻融以破裂线粒体外膜以便能更有效地进行CCO活性测定16。CCO测定采用紫外分光

10、计在550 nm波长下测定还原态细胞色素C的氧化量，测定温度为25 ，反应时间为4 min，反应体系为pH = 7.5的100 mmol/L K3PO4 和0.05 mmol/L 的还原态细胞色素C。CCO活性单位（U）为每毫克线粒体蛋白1 min内将底物转化为产物的摩尔数。还原态细胞色素C是通过在细胞色素C中加入过量的连二亚硫酸二纳来还原产生，还原过程通过加入足量的气泡以去除多余的连二亚硫酸二纳17。1.5 肌肉酶活分析从每只蟹的螯足中称取0.2 g肌肉，加入2 mL缓冲液（10 mmol/L EDTA Na2，10 mmol/L Tris，0.5% BSA，pH = 7.5）进行匀浆。使用

11、Polytron组织匀浆机以20%最大速匀浆两次，每次45 s，每次间隔1 min。匀浆在4 、4000 g条件下离心10 min，取上清液用于酶活测定。酶活测定的温度为25 。采用修改的Thibault 17方法测定LDH，其反应体系为0.1 mol/L K3PO4，0.32 mmol/L NADH, 1.6 mmol/L Pyruvate，pH = 7.0。采用修改的Hansen18方法测定HK和PK。HK的反应体系为55 mmol/L Tris，10 mmol/L MgCl2，80 mmol/L glucose，24 mmol/L ATP，1.6 mmol/L NADP，14 U glu

12、cose-6-phosphate dehydrogenase，pH = 7.4。PK的反应体系为25 mmol/L imidazole，10 mmol/L MgSO4，100 mmol/L KCl，5 mmol/L ADP，2 mmol/L PEP，0.3 mmol/L NADH，5.5 U lactate dehydrogenase，pH = 7.4。三种酶活性的测定均使用紫外可见分光光度计（Cary 100）在340 nm波长下测定NADH或NADP的增减量，活性单位（U）为每克组织湿重1 min内将底物转化为产物的摩尔数。1.6 数据处理所有数据用平均值标准差表示。采用SPSS 13.0

13、 统计分析软件，通过t-检验分析同一海域南、北种群线粒体呼吸速率和酶活性的差异，单因素方差和LSD多重比较分析不同海域南、北种群线粒体呼吸速率和酶活性的差异。显著和极显著水平分别设置为p0.05和p0.01。2 结 果2.1 线粒体呼吸速率在本研究中，无论是使用琥珀酸还是丙酮酸+苹果酸为底物，拟穴青蟹鳃、肌肉和肝胰腺线粒体状态2和状态4呼吸速率差异很小，但状态2或状态4与状态3的呼吸速率则有很明显的差异，所以本研究选择拟穴青蟹鳃、肌肉和肝胰腺线粒体状态2呼吸速率与状态3呼吸速率的测试结果进行分析比较，兹分述如下：2.1.1 鳃如图1所示：拟穴青蟹北方种群和南方种群鳃线粒体呼吸速率在测试的三个海

14、域其变化规律相似，其状态2和状态3呼吸速率均表现为宁波海域最高，儋州海域最低，漳州海域介于两者之间，即北方种群和南方种群的鳃线粒体各状态的呼吸速率均随着纬度的升高而升高。在测试的三个海域，同一海域北方种群鳃线粒体呼吸速率总是显著高于同一海域南方种群（p0.05），其中宁波海域使用琥珀酸为底物测得的状态3呼吸速率（北方种群为70.543.35 nmol O2min-1mg-1，南方种群为50.946.05 nmol O2mg-1）、漳州海域使用琥珀酸为底物测得的状态2（北方种群为11.171.93，南方种群为7.232.05）和状态3呼吸速率（北方种群为46.8812.76，南方种群为28.026.12）差异更为显著（p0.01）（图1）。*和*分别表示同一海域北方种群与南方种群差异显著（p0.05）和极显著（p0.01）；不同的大