1、无性繁殖 个体水平,(一)基因(gene)基因 从化学上来说,指的是一段DNA或RNA顺序,该顺序可以产生或影响某种表型(genotype,phenotype),从遗传学上来说,基因代表一个遗传单位,一个功能单位,一个突变单位。(二)基因工程(genetic engineering)基因工程 有目的的通过分子克隆技术,人为操作改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程。,第一节 概论,一、历史1944 肺炎双球菌转化实验证实DNA是遗传物质1953 DNA双螺旋模型1960s 遗传密码、中心法则1970 反转录酶1946 质粒1968-70 限制酶1972 不同来源的DNA片段体外
2、连接成重组DNA分子1973 转化、筛选重组质粒的阳性克隆,The transforming principle is DNA.,DNA is the genetic material,肺炎双球菌转化实验,The Double Helix(1953),The foundation of molecular biology,Francis H.Crick James D.Watson,中 心 法 则,二、基因克隆的特点和技术路线,技术路线:1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆,大量扩增特点:分子
3、水平操作,细胞水平表达,基本原理,基因克隆技术路线,切,接,转,筛,分,常用的工具酶(tool enzymes)有:1.限制性核酸内切酶(resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连接酶(DNA ligase,ligase)3.逆转录酶(reverse transcriptase)4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminal transferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用,最为重要。工具酶现已商品化。,第二节 工具酶,一、限制性内
4、切酶定义:特异性识别双链DNA并进行切割的酶。内切:在DNA内部切割 限制性:识别特异位点切割-GAATTC-CTTAAG-EcoR酶切位点,命名(1973年Smith 原则、型酶)根据分离此酶微生物的学名,一般取3个字母。第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母罗马字母、从一种微生物中发现了几种不同特异性限 制酶,按发现顺序排列 如EcoR是指从大肠杆菌(Escherichia coli)R 株分离得到的第一种限制酶。,命名酶的来源 Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系酶的名称
5、 Hind,分类 DNA底物 双链DNA 双链DNA 双链DNA 辅因子 Mg2+ATP SAM Mg2+Mg2+ATP 识别序列 特异 特异 特异切割位点 非特定 特定 特定 识别序列前后 之中 之后25bp27bp 100-1000bp修饰作用 有 无 有,限制酶的识别位点 一般特征(4点):(1)型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点(或切割位点)。(2)它能识别DNA的46bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是46bp,有6个以上的,但没有4个以下的。(3)识别顺序呈二重对称,即1800旋转对称。如:(4)酶靶顺序大小是很重要的,它决定产生特定DNA中段的大小。若DNA碱
6、基组成是均一的,限制酶切点是随机的,那么对于:要求4bp靶序列如Hpa,Mbo等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列,即1/256 同理,要求6bp的酶,则平均46遇到一个靶序列,即1/4096。,GGATCCCCTAGG,BamH,特点型限制酶:识别4-6个核苷酸 识别的核苷酸具有回文结构 可以形成平末端、粘末端 切口概率 星号活力,星号活力定义:限制酶在非标准反应条件下,能够切割一些与其特异识别的序列类似的序列的现象。影响因素:甘油浓度过高,低离子强度,限制酶用量过大,高PH,有机溶剂污染表示方法:在相应的酶上加星号表示。EcoR(*),如EcoRI切割后产生5末端突出的粘性末
7、端;5GAATT C3 5G-OH p-AATTC3 3C TTAAG5 3CTTAA G5PstI切割后产生3末端突出的粘性末端:5C TGCAG3 5CTGCA-OH p-G3 3GACGT C5 3G ACGTC5还有一些酶沿对称轴切割DNA,产生平端或钝端(blunt end)如SmaI:5CCCGGG3 5CCC GGG3 3GGGCCC5 3GGG CCC5,型限制酶切口特点,1异源同工酶(Isoschizomers)也称同裂酶:来源不同,识别顺序相同,切割方式可同可不同:(1)识别顺序与切割方式同,如:Mbo和 SauS(NNGATCNN-3)-NNCTAGNN-5(2)识别顺序
8、同,切割位点不同,如:Sma CCCGGG 和 Xma CCCGGG(3)识别与切割相同,但其中一酶可以切“修饰”(甲基化*),另一酶不能。HpaCCGG 和 MspCCG*G MboGATC 和 Sau 3A GA*TC,几种特殊的内切酶,2.一个位点包含在另一个位点之中 Hpa CCGG Sma CCCGGG Sma的6个bp含Hpa的4个bp顺序,所以Hpa 能识别与切割Sma的6个bp,但含有Hpa的ccgg的其它6核苷酸 顺序不能被Sma切割。3同尾酶 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G
9、A CTAG T,杂种位点(hybrid site)由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T 杂种位点:G GATC A C CTAG T,二DNA连接酶 1.DNA连接酶:大肠杆菌染色体编码 粘末端连接 NAD+供能 2.T4 DNA连接酶:大肠杆菌T4噬菌体DNA编码 粘末端、平末端连接 已知唯一平末端连接酶 ATP供能,DNA连接酶是基因工程重要的工具酶,常用T4DNA ligase.(一)功能:催化有互补顺序的两个DNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5
10、P连接作用。(二)来源噬菌体T4感染E coli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。(三)催化反应:需要ATP、Mg2+作辅助因子;对粘性末端催化活性大于平头末端,DNA连接酶在限制片断的末端连接作用 分子间的连接:不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接:由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。,三、聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶(全酶)大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow大片段 T4噬菌体DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)AMV MLV,(1)53DNA聚合酶活性(2)35外切酶活性(3)53外切酶活性
11、,大肠杆菌DNA聚合酶(全酶),酶用途:,酶活性:,(1)cDNA第二条链的合成(2)3凹陷粘末端的标记,平端化(3)缺口平移法标记DNA探针,5 3DNA聚合酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶的大片段Klenow片段酶 基因工程很多情况下,E.coli DNA pol可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。酶活性:1.53DNA聚合酶,2.35外切酶活性。酶用途:(1)补平3凹陷粘性末端(2)同(1),填平过程中,用32P dNTP标记DNA片段3末端。(3)cDNA克隆中,用于合成cDNA的第二条链。(4)在Sanger双脱氧法 ddNTP系统进行序列分析。,1.来源 源
12、于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性,相似于Klenow片段,但远远强于Klenow片段(1)53 聚合活性(2)35 外切酶活性 3.基因工程中用途与Klenow片段一致(标记末端,填平5末端),不同的是可对3突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的35外切酶活性切除3突出端,产生3凹端。,T4噬菌体DNA聚合酶(T4 DNA pol),反转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶),催化以RNA为模板反转录生成 DNA。最初禽类成髓细胞中分离。主要用于反转录mRNA生成cDNA。,RNA指导的DNA合成反应;RNA的水解反应;DNA指导的DNA合成反应。,AMV:42 MLV:37,分类
13、,作用,活性,反转录酶,反转录酶还具有RNaseH活性,碱性磷酸酶酶活性:催化核酸的5 端脱磷酸反应酶用途:5 末端标记和防止载体自身连接,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,目的基因与载体,因子两端正好有两个酶切位点BamH和EcoR,切割后得到1500bp的片段。,一、目的基因的获取方法,1、染色体DNA的限制性内切酶酶切片段,2、通过mRNA反转录合成 cDNA,DNA聚合酶,碱水解,T T T T,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,3、从基因组DNA文库获取目的基因
14、,4、从cDNA文库获取目的基因,8、最常用的方法:索取,5、PCR扩增目的基因,6、人工体外合成基因片段,7、根据蛋白质序列推导,基本原理,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,二、载体 能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。特性:1 复制起点 2 多克隆位点:多种限制酶的单一切割位点3 筛选标志 Amp+Kan+Neo+4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低5 表达载体:还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核 定位序列等,载体的分类,质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小型环状双链D
15、NA分子。大小约为数千碱基对,一般310kb。常有1-3个抗药性基因,以利于筛选。在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息,如抗药性。具有自主复制的能力,但不能独立存活。接受的DNA大小有限,小于15kb.,存在于细菌细胞质中 双链环状DNA分子 大约 310 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息,特性,15 kb 一般310 Kb 左右,接受的DNA片段长度,主要用于外源基因的克隆和保存,是一种比较原始的克隆载体。pBR322:B,bacteria;R,Resistance.,pBR322,3、常用质粒,pBR 322 4361 bp Tetr AmprpUC 18/19 2686 bp Ampr LacZ pGEM-3Z 2743 bp Ampr LacZpUC 118/119 3162 bp Ampr LacZ,噬菌体(bacteriophage),特点:约50kb,容纳1822kb片段线性双链,天然粘性末端感染宿主细
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