扫描电镜生物样品制备技术PPT格式课件下载.ppt

1、漂洗、换洗、加压冲洗、漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声振荡超声。化学方法化学方法:用酶消化法用酶消化法注意事项：注意事项：在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型清洗液的选择清洗液的选择清洗液的选择清洗液的选择一般组织：等渗生理盐水一般组织：等渗生理盐水游离组织细胞：缓冲液、等张液游离组织细胞：缓冲液、等张液表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）表面覆有大量黏液的组织（

2、如胃肠粘膜）表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：低浓度蛋白水解酶：低浓度蛋白水解酶组织培养细胞：组织培养液组织培养细胞：组织培养液特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，选用去垢剂，选用去垢剂，选用去垢剂，选用去垢剂 Triton X-100Triton X-100）三、三、固定固定目的：目的：保存样品表面的真实结构；硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品的损伤；对样品的损伤；提高样品的二次电子发射率；提高样品的耐热性和导电性。常用的固定剂：2.5%戊二醛（戊二醛（1 3h）1.0%四氧化锇四氧化锇（301h）固定温度

3、：固定温度：室 温，一般以室 温，一般以 4 为宜。为宜。四、脱水四、脱水 要求：不改变样品的体积和表面积的情况 要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。下，去除样品中的水份。常用的脱水剂：乙醇、丙酮 常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水方法：梯度脱水时间：视样品大小而定时间：视样品大小而定注意事项：避免裸露，夹伤注意事项：避免裸露，夹伤五、五、干燥干燥干燥干燥目的：去除样品中的脱水剂目的：去除样品中的脱水剂 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、方法：空气干燥法、冷冻干燥法、叔丁醇干燥法、叔丁醇干燥法、临界点干燥法等临界点干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法常用干燥

4、法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法空气干燥法空气干燥法空气干燥法空气干燥法方法方法方法方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度，退回至度，退回至度，退回至度，退回至 85%85%脱水剂，取出，空气中自脱水剂，取出，空气中自脱水剂，取出，空气中自脱水剂，取出，空气中自然干燥。然干燥。优点优点优点优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程中减少了样品的收缩及损伤程中减少了样品的收缩及损伤程中减少了样品的收缩及损伤程中减少了样品的收缩及损伤缺点缺点缺点缺点：常常使样品发生变形收缩：常常使样品发生变形收缩适用范围适用范围适用范围适用范围：铸型或体表

5、比较坚硬的甲壳昆：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫等含水量较少的样品虫等含水量较少的样品虫等含水量较少的样品虫等含水量较少的样品冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法方法方法方法方法：将含大量水分的生物样品迅速投入：将含大量水分的生物样品迅速投入液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂直接由固态转为气态，样品随之得脱水剂直接由固态转为气态，样品随

6、之得脱水剂直接由固态转为气态，样品随之得脱水剂直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。到干燥。不存在气相与液相间的表面张力问：不存在气相与液相间的表面张力问题，故对样品损伤较小。题，故对样品损伤较小。缺点缺点缺点缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤，费时。伤，费时。适用范围适用范围适用范围适用范围：含水量较多的生物样品：含水量较多的生物样品叔丁醇干燥法 叔丁醇干燥法 叔丁醇干燥法 叔丁醇干燥法（1）乙醇梯度脱水至）乙醇梯度脱水至 100/2次 次 （2）叔丁醇与乙醇混合液置换至）叔丁醇与乙醇混合液置换至 100%叔丁醇叔丁醇 70、80、90 、95 和 和 1

7、00/2 次次 5-10min/次次（3）在样品表面滴上）在样品表面滴上 100%叔丁醇叔丁醇（4）将标本置于）将标本置于 4 以下使样品快速固化以下使样品快速固化（5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。临界点干燥法临界点干燥法 原理原理：利用物质在临界状态时，气相与液相：利用物质在临界状态时，气相与液相 的界面消失，样品在没有表面的界面消失，样品在没有表面张力的 张力的 情况下进行干燥。情况下进行干燥。步骤步骤：脱水 置换（醋酸异戊酯）：脱水 置换（醋酸异戊酯）预冷 放入样品预冷 放入样品 注入液态注入液态 CO2 CO2置换 置换 CO2加温气化 排

8、除加温气化 排除 CO2温度温度：31.4 度度压力压力：73 个大气压个大气压临界点干燥法临界点干燥法空气干燥法空气干燥法 Comparison between critical point drying and air drying 六、六、粘托粘托 SEM 样品在干燥处理样品在干燥处理或金属镀膜之前，需用特或金属镀膜之前，需用特制导电胶或双面胶将样品制导电胶或双面胶将样品粘贴在金属样品台上。粘贴在金属样品台上。导电胶一般具导电胶一般具有黏着力较强、容易挥发有黏着力较强、容易挥发固化、干燥后表面电阻率固化、干燥后表面电阻率低、导电性能好等特点。低、导电性能好等特点。要点：稳，钝角要点：稳，

9、钝角样 品 粘 托样 品 粘 托Fixing the specimen 七、镀膜（样品的导电处理）七、镀膜（样品的导电处理）目的：使样品导电，增加二次电子的发射率目的：使样品导电，增加二次电子的发射率金属镀膜技术：包括金属镀膜技术：包括真空喷镀法真空喷镀法和和离子溅射法离子溅射法真空喷镀法真空喷镀法 方法方法：在高真空中使金属加热蒸发，在：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金样品表面沉积形成一层金属膜。属膜。缺点缺点：金属损耗大，容易产生污染和热：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成“死角”。损伤，容易形成“死角”。离子溅射法离子溅射法原理：原理：利用气体在低真空中的辉

10、光放电所产利用气体在低真空中的辉光放电所产生的高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打生的高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样出金属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒品。在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与气体分子之间要发生相互撞击，改变了金子与气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，属粒子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀所以在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属膜。的金属膜。离子溅射的优点：要求的真空低要求的真空低 工作温度低工作温

11、度低 金属粒子无方金属粒子无方向向 连续的、厚度连续的、厚度均匀均匀 甲 虫 甲 虫 3kV大肠杆菌耳蜗尿酸钠结晶尿酸钠结晶红细胞红细胞巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬上左：兔肾小体细胞上左：兔肾小体细胞上右：血细胞发生上右：血细胞发生下图：十二指肠绒毛下图：十二指肠绒毛 SEMSEM 觀察苗木下表皮氣孔分觀察苗木下表皮氣孔分佈及葉部組織之微細構造佈及葉部組織之微細構造 A A：氣孔密度：氣孔密度（橫線橫線=120m=120mm）m）B B：氣孔形態：氣孔形態（橫線橫線=12mm）=12mm）C C：葉組織：葉組織（橫線橫線=120mm）=120mm）A AB BC CSEMSEM 觀察泡桐根瘤線蟲微細構造 觀察泡桐根瘤線蟲微細構造 SEMSEM 觀察