新冠核酸检测技术PCR实验室质量体系文件第三部份项目类SOPWord文档下载推荐.docx

1、S0P_18-8仪器申请、采购、验证和管理程序20-20S0P_18-9试剂的质检标准操作程序21-21S0P_18-10实验室残留试剂药品、废弃物处理程序22-22S0P_18-ll实验室生物防护程序23-23S0P_18-12PCR实验室仪器故障、试剂耗材发生质量问题的应急处置程序24-25S0P_18-13抱怨的处理程序26-27S0P_18-14实验室记录的管理28-29S0P_18-15实验室化学试剂的管理及配置标准操作程序30-32S0P_18-16标本的采集、验收和保存的标准操作程序33-35S0P_18-17标本与扩增板次唯一标识编号程序36-36S0P_18-18实验室室内质

2、量控制标准操作程序37-38S0P_18-19实验室室间质量评价标准操作程序39-39SOP_18-20新型冠状病毒核酸检测结果分析与报告管理及可疑、阳性结果 讨论审签制度40-48S0P_18-21新型冠状病毒核酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置应急预案49-53第二部分仪器类SOPS0P_18-22移液器使用、维护与校准标准操作程序54-55S0P_18-23移动紫外线消毒车使用、维护与校准操作程序56-56S0P_18-24传递窗操作程序57-57S0P_18-25生物安全柜使用、维护与校准操作程序58-60S0P_18-26Cleancube Mini过氧化氢空间消毒器使用、维护与校准操

3、作程序61-64S0P_18-27台式高速冷冻离心机使用、维护与校准操作程序65-66S0P_18-28高压蒸汽灭菌器使用、维护与校准标准操作程序67-68S0P_18-29超净工作台使用、维护与校准标准操作程序69-69S0P_18-30旋涡振荡器使用与维护标准操作程序70-70S0P_18-31冰箱使用、维护与校准操作程序71-72S0P_18-32天隆GeneRotex 96全自动核酸提取仪使用、维护与校准程序73-74S0P_18-33MA-6000基因扩增检测仪使用、维护、校准程序75-81S0P_18-34优思达UC0102核酸扩增检测分析仪使用、维护、校准程序82-84第三部分项

4、目类SOPS0P_18-35临床标本的处理（核酸纯化）程序85-86S0P_18-36新型冠状病毒2019-nCoV基因（达安红盒）扩增检测操作规程87-92S0P_18-37新型冠状病毒2019-nCoV基因（金豪）扩增检测操作规程93-97S0P_18-38新型冠状病毒2019-nCoV基因（之江）扩增检测操作规程98-103S0P_18-39优思达新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测操作程序104-106SOP_18-40新型冠状病毒2019-nCoV基因（中元）扩增检测操作规程107-111文件审批者；发布日期：年 月曰S0P_18-35临床标本的处理（核酸纯化）程序1.目的保证

5、标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。2.范围新冠病毒核酸提取。3.职责新冠病毒标本检测项目的工作人员按此文件操作执行。4.工作流程4. 1接收样本在接收样本前，检测人员需要按照三级防护标准穿戴好，穿着防护衣、护目镜、隔离衣, 并戴上N95 口罩、双层手套，穿上靴套等。然后用75%的乙醇对实验室内的生物安全柜的空间 和台面以及核酸提取仪等进行消毒，还需对标本转运箱进行消毒，并核对被检样本姓名、性 别、年龄、编号及检测项目等，待确认转运箱完好后将其放入生物安全柜。4. 2病毒灭活已经使用含服盐的灭活型标本采样管的实验室，这一环节无需进行灭活处理，直接进行 核酸提取

6、，而使用非灭活型标本采样管的实验室，则有56C孵育30分钟热灭活的处理方式， 病毒灭活后为避免开盖后气溶胶污染实验室和检测人员，常温静置15分钟以上再执行下一步 操作。4. 3核酸提取1）标本操作人员穿戴三级防护用品，在生物安全柜内将离心管依次编号。2）取出病毒提取试剂，对应标本编号。3）用旋涡混匀器对标本进行混匀，把可能含有病毒核酸的细胞从拭子标本中洗脱下来。4）在生物安全柜当中，一人开盖，一人加样，用移液器加混悬液200uL标本到提取液当中。5）裂解10分钟。6）把裂解好的核酸提取盒放入半自动核酸提取仪当中，按预先设置好的程序提取核酸。7）核酸提取完成后在生物安全柜内，将提取的核酸加至PC

7、R扩增反应体系。4.4核酸分析，等待结果在生物安全柜内，将提取的核酸加至PCR扩增反应体系，然后将构建好的扩增体系放入 扩增仪，进行核酸扩增后分析。4.5消毒，废物处理一系列步骤完成后，需要对实验废物进行处理，并对实验仪器、桌面、地面进行消毒。待检测结果出来后，对检测到的阳性、可疑阳性样本按SOP_18-20新型冠状病毒核酸检测结 果分析与报告管理制度、S0P_18-21新型冠状病毒核酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置 应急预案进行处置。5相关记录5.1 YCXZYY/JYK-JL-SOP_18-35-01 附表 21 PCR 实验室流程图S0P_18-36新型冠状病毒2019-nCoV基因（达

8、安红盒）扩增检测操作规程1.名称新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）2.目的规范新型冠状病毒（2019-nCoV） RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确 性和重复性。3.方法TaqMan探针实时荧光定性。4.检测原理基于一步法RT-PCR技术，选取2019新型冠状病毒（2019-nCoV） ORFlab和N基因作为扩 增靶区域，设计特异性引物及荧光探针（N基因探针采用FAM标记，ORFlab探针采用VIC标 记）用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测；同时包括内源性内标检测系统（内标基因探 针采用Cy5标记），用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增

9、过程的监控，可减少假阴性结 果的出现。5.样品咽拭子、痰液等6.试剂中山大学达安基因股份有限公司组分名称规格数量主要成分PCR检测试剂（大包装，96 人份/盒）2019-nCoV PCR 反应液 A918HL/管2特异性引物、探针、三羟 甲基氨基甲烷-盐酸缓冲 液2019-nCoV PCR 反应液 B204M-L/ 管热启动Taq抗体酶、Taq 酶、OMMLV 酶、dNTPs、 UDG 酶、RNasin2019-nCoV阴性质控品450ML/管含2019-nCoV内标片段（RNase P基因）的假病 毒、TENC（ORFlab/N）阳性质控品400ul/管含2019-nCoV目的片段 的假病毒

10、、含2019-nCoV 内标片段（RNase P基因） 的假病毒、TE7.仪器苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。8.操作步骤8. 1 PCR试剂准备（I区）8. 1. 1从试剂盒中取出2019-nCoV PCR反应液A、2019-nCoV PCR反应液B ,室温融化后振 荡混匀，掌上离心机离心10秒后使用。8. 1.2取N个（N=待测样本个数+NC（0RFlab/N）阴性质控品+NC （ORFlab/N）阳性质控品）PCR 反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将 20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区

11、II区传递窗。NC单人份扩增体系配制如下表:扩增体系17ul3ul20ul8. 1. 3试剂准备区清洁:每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验 室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8. 2核酸模板提取（II区）核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取 或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。8. 3加样（II区）在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控 品、弱阳性质控品各5ul,盖紧管盖，6, OOOrpm离心数秒后，置II区III区传递窗。标本制

12、备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mg/L含氯消毒剂喷洒至完全湿 润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用 2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8. 4PCR扩增检测（III区）8. 4. 1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。8.4. 2循环参数设定：序号步骤皿反时间循环数1反转录反应50C2分钟循环1次预变性953变性5秒循环10次退火、延伸6035秒4循环32次退火、延伸及检测荧光8. 4.3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。9.结果分析选择定性分析模式，

13、自动调整阈值，必要时可手工设定，以刚好超过正常阴性对照品扩 增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情 况进行调整。10.质控标准10. 1 2019-nCoV阴性质控品：FAM和VIC检测通道无Ct值或无明显扩增曲线，Cy5 通道 Ct 25；10. 2 2019-nCoV阳性质控品：FAM和VIC检测通道Ct值22；10.3以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性混合样本）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。11.结果判断FAM 通道（green）N基因VIC