细菌耐药机制(huishi)PPT资料.ppt

1、,“先天不足”,一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。亚胺培南是一种非典型的-内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。,“后天获得”,产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株,亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌PFGE图,C1 C2:亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药,亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌SDS图,C1 C2:亚胺培南耐药,PCR扩增Omp36全长及序列分析,IS903

2、98%,（约1000bp）,插入序列引起OprD2缺失（铜绿）,细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性细菌产生的灭活酶主要有：-内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶 氯霉素乙酰转移酶 MLS钝化酶,二、产生灭活酶,-内酰胺酶,临床上最重要的-内酰胺酶,是质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类中属于2be类酶。,超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum-lactamases，ESBLs）,E

3、SBLs的分类,根据基因同源性不同分为：TEM型 80SHV型 46CTX-M型 37OXA型 18其它型 20,http:/www.lahey.org/studies/webt.htm.,CTX-M-1组CTX-M-2组CTX-M-8组CTX-M-9组,中国400株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布,32家医院 1994-2003年大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率,头孢菌素酶,大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的AmpC酶。,阴沟肠杆菌,ACT-1,DHA-1,CMY（Peking）,DHA-1,CIT,A

4、CT-1（Shanghai）,DHA-1（Zhejiang）,DHA-1,ACT-1（GuangZhou）,DHA-1 is The Predominant Type in China,Map of China,克隆片段,PCR产物1100bp,共6432bp,ORF1,ORF2,ORF3,ORF4,ORF5,ORF6,IS26,orf-1,DHA-1 ampR qacE1 sul1,5232 bp,指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类内酰胺酶分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。,碳青霉烯酶,天然来源碳青霉烯酶嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶获得性碳青霉烯酶（Am

5、bler分子分类）B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54,碳青霉烯酶按其来源可分为,金属酶,染色体编码的金属酶：BC，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。获得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于可转移的基因元件上，造成区域性传播。,IMP型金属酶,IMP型金属酶GenBank上已公布21种，比较它们相互之间的序列表明：IMP型金属酶大致可以分为两组：1）IMP-1、IMP3-7、IMP911、IMP-16 2）IMP-2和IM

6、P-8、12、13、19、20,中国,IMP-4 2001年香港 鲍曼 2001年广州 杨格枸橼酸杆菌、铜绿IMP-1 2004年12月 江苏无锡 铜绿IMP-8 2001 台湾 铜绿,VIM型金属酶,VIM型金属酶 与IMP类金属酶同源性40，但两类金属酶的动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。目前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间的序列可将VIM金属酶大致分为三组：1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b 3）VIM-7,VIM型金属酶分布,VIM-1 1999年 意大利 铜绿 氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单胞 20032004希

7、腊 大肠 肺克 法国 肺克VIM-2 2000 法国 铜绿 意大利 希腊 日本 韩国 葡萄牙 西班牙 波兰 克罗地亚 智利 阿根廷 美国 中国VIM-3 2001年 台湾地区 铜绿VIM-4 2002年 希腊 铜绿 2003 瑞典 铜绿 2004 意大利 肺克 阴沟 2004 波兰 铜绿,VIM-5 2004 土耳其 肺克 铜绿VIM-6 2004 新加坡 恶臭假单胞VIM-7 2004 美国 铜绿VIM-8 哥伦比亚 铜绿VIM-9，10 英国VIM-11 阿根廷 意大利,VIM型金属酶分布,亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶检测结果,VIM-2基因整合子结构图,A：B2，B3，B28，H19，

8、H26，H54，G4 结构同In72B：S5，S9，S10，S11，S12（S15、H22除外）,AB,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,50kb,A,B,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,PFGE谱分析结果：共有七种类型，来自上海的六株为同一类型，来自北京的三株分两个类型，来自杭州的四株同样也分两个类型。各地区之间的类型各不相同。反复尝试通过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。经XbaI内切酶消化的染色体PFGE与VIM-2探

9、针杂交显示其中10株铜绿假单胞菌50-kb大小的酶切片段杂交阳性，而其余3株（H22、H26、B2）没有阳性片段。,类酶包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1-4酶、铜绿假单胞菌中质粒介导的GES-2酶。,碳青霉烯类抗生素水解酶,二株产IMI-1阴沟肠杆菌PFGE结果,E cloacae 8,E C600,E.coli C600E8，E.coli pT103和E.coli DH5对抗菌药物的体外抗菌活性,阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱,M1A B M2,54kb,15kb,Schematic repres

10、entation of the cloned E.coRfragment,IS903,IMI-2,Imi-2R,IS903,IS2,903bp 921bp 882bp 876bp 921bp,10629bp,（GenBank accession number:AY780889）,Imi-R与ImiR同源性为97%。IMI-2与IMI-1同源性99%，仅在37位由天冬氨酸天冬酰胺，106位由组氨酸酪氨酸,多重耐药肺炎克雷伯菌,转化试验,抽提亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌质粒转化DH5，在含1g/ml的亚胺培南的MH平板上筛选成功筛选到亚胺培南耐药的转化菌（转化质粒约60kb）,染色体带,61kb,P

11、CR,PCR筛选内酰胺酶耐药基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC转化菌和克隆菌只有KPC阳性PCR产物测序分别为TEM-1、SHV-12和KPC-2,转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆）,EcoR,Hind，Nhe等,酶切,Nhe,pTeasy Vector,pTeasy Vector,1.5kb,在含亚胺培南1g/ml MH平板筛选,克隆片段测序,对重组质粒的插入片段进行步移测序，获得1554bp核苷酸 DNAssist软件分析，1个开放读码框（ORF）经Gen

12、Bank Blast程序分析，该ORF与KPC-2（GenBank注册号:AY210886）的核苷酸序列同源性为100%,D类酶（OXA酶）在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力,碳青霉烯类抗生素水解酶,blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我国鲍曼不动杆菌最主要的碳青霉烯酶，ISAba1与OXA基因的表达和转移密切相关

13、,342株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中339株检测到至少一种OXA基因，303株检测到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只检测到OXA-23-like基因，17株只检测到OXA-51-like基因；其中在313株菌株的OXA-23-like基因上游34bp处检测到ISAba1，在13株菌株的OXA-51-like基因上游7bp处检测到ISAba1。,氨基糖苷类钝化酶分为：磷酸转移酶（APH）乙酰转移酶（AAC）核苷转移酶（ANT）氨基糖苷类钝化酶作用机制：三者分别使抗生素的羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体结合。,氨基糖苷类耐药,庆大霉素高水平耐药

14、（HLGR）主要的耐药机制 氨基糖苷类修饰酶 耐药基因 百分率 AAC（6）-Ie-APH（2）-Ia aac（6）-Ie-aph（2）-Ia 90%APH（2）-Ic aph（2）-Ic APH（2）-Id aph（2）-Id APH（2）-Ib aph（2）-Ib,10%,氨基糖苷类耐药,8,724bp,ORF1,ORF2,ORF4,ORF3,5,3,ISEcp1（tnpA）,aph-Ie,repD,str部分序列,一种新的质粒介导的肠球菌氨基糖苷类耐药基因aph（2”）-Ie,三、靶位改变,主要抗菌药物作用靶位,-内酰胺类 青霉素结合蛋白（PBP）氨基糖苷类 核糖体30S亚基大环内酯类

15、核糖体50S亚基氟喹诺酮类 DNA旋转酶（拓扑异构酶）、拓扑异构酶糖肽类 D-丙氨酰D-丙氨酸四环素类 核糖体50S亚基,PBP2a的作用,PBP2a与-内酰胺抗生素亲和力低，替代正常PBP功能 87KdaPBP1 80 PBP2 78 PBP2a 75 PBP3 70 PBP3 41 PBP4,DR,IR,IR,DR,SCCmec,SCCmec,IV型,VS,HA-MRSA,CA-MRSA,高 耐药性 较低 阴性 PVL 阳性I、II、III SCCmec IV、V,金葡菌耐药性的发展历程,S.aureus,Penicillin-resistantS.aureus,Methicillin-resistantS.aureus（MRSA）,Penicillin,Methicillin,Vancomycin-resistantenterococcus（VRE）,Vancomycin（glycopeptide）-Intermediate-ResistantS.Aureus（VISA、GISA）,Vancomycin-ResistantS.Aureus