耐盐产酯酵母的筛选鉴定及其特性广东轻工职业技术学院Word格式文档下载.docx

1、耐盐；筛选；鉴定；特性Screening, Identification and Characterization of a Salt-tolerant and Ester-producing YeastHUANG Gui-feng, YE Zhi-lin, MA Xiao-wen, SU Shi-qi, JIANG Min-hua, TANG Jing-jun, SHI Jun-bo, TONG Hui-shao, CHEN Wei-xin, LI Jing, DENG Mao-cheng （Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 51

2、0300）Abstract: In order to upgrade the flavor of high-salt fermentation paste products, high ester-producing and salt-tolerant strains were screened from natural fermentation chili sauce. The strain DZ-3 with the highest ester-producing capability was obtained by fermentation screening and product a

3、nalysis. DZ-3 was identified as Trichosporon cutaneum by using the morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics and 18S rDNA sequences analysis.By means of optimization tests, the optimal nitrogen resource for strain DZ-3 was yeast extract and the best fermentation co

4、nditions for ethyl acetate-producing were determined as temperature of 28 C, initial pH of 6.0 and rotation speed of 200 rpm. The highest yield of ethyl acetate reached 3.84 g / L with the optimal condition. Series of salt tolerance tests were performed in a medium containing 0 180 g / L sodium chlo

5、ride and strain DZ-3 showed good salt resistance.Key words: ester-producing yeast; salt tolerant; screen; identification; characterization引言 酯类是酒类、酱类的重要香气物质，这些产品中常见的酯类有甲酸丁酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等1-2。产酯微生物通常有酵母菌、霉菌和细菌，酵母菌在产酯的研究及应用中较为普遍3-5。但是，由于我国酱类发酵的盐度较高，风味品质不仅要求微生物具有较高的产酯能力，还对微生物的耐盐性有很高的要求。随着高端发酵型酱类的市场需求日

6、益扩大，耐盐产酯微生物的研究及应用逐渐成为发酵型酱类领域的热点。为了提高发酵型酱类的风味品质，本实验主要探索耐盐产酯微生物的筛选及其基本特性。1 材料与方法1.1 材料与主要试剂 筛选材料：自然发酵的辣椒酱；无水乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯：色谱纯，市售；其它试剂：市售。1.2 富集培养与平板分离 富集培养基：葡萄糖 50 g/L，乙醇 10%（v/v），酵母膏 10 g/L，NaCl 100 g/L，KH2PO4 2.0 g/L；先将乙醇以外的组分溶于纯净水，调节pH至4.5，121C灭菌20 min，冷却至室温，然后加入无水乙醇，混匀。平板培养基：葡萄糖 20 g/L，酵母膏

7、10 g/L，蛋白胨 10 g/L，琼脂 20 g/L，pH4.5。斜面培养基的组成同平板培养基，pH7.0。 称取10 g自然发酵辣椒酱，接入200 mL的富集培养基，置于28 C、200 rpm的条件下振荡培养24 h。在无菌操作条件下，梯度稀释培养液，涂布于平板培养基上，28 C培养36 h。从平板上挑取单菌落，接入斜面培养基，28 C培养24 h，放入4 C冰箱保藏，备用。1.3 产酯酵母的筛选 摇瓶发酵的基础培养基：葡萄糖 50 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO47H2O 0.5 g/L，pH7.0。用接种环挑取上述分离菌株的斜面菌种，接入发酵培

8、养基，100 mL发酵培养基的接种量为1环，置于28 然后，检测各菌株发酵液中的总酯，根据检测结果筛选出酯类高产菌株。1.4 总酯的测定 在8000 rpm的条件下对发酵液进行离心20 min，收集清液，加入等体积的纯净水，于100 C进行蒸馏，直至馏出液为总体积的50%。然后，采用回流皂化法测定馏出液中的总酯（以乙酸乙酯计）6。1.5 产物的GCMS分析 利用气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010 Plus （日本岛津公司）对馏出液中的组分进行分析。GC条件：进样口温度250 C，色谱柱Rtx-WAX （30 m 0.25 mm 0.25 m），柱温35 C，保持2min，程序升温10 C

9、 /min，至250 C保持5min，载气He，流速 1.0 mL/min，柱前压68 kPa，分流比10:1，进样量1 L。MS条件：EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围10-400，离子源温度230 C，检测器电压1.20 kV，GC/MS接口温度250 C。以乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等作为标准品。1.6 菌种鉴定 参照酵母菌的特征与鉴定手册中的鉴定方法7，对筛选所得的高产菌株进行显微镜检查和生理生化试验，并利用扫描电镜进行菌体形态观察和摄像。参照文献的方法8，采用通用引物（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3和5-TCCGCAGGTTCACCTAC

10、GGA-3） 对18S rDNA进行PCR扩增，PCR产物经纯化后，送至深圳华大基因科技服务公司进行序列测序，将拼接后的序列输入NCBI（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行同源性检索，从而对高产菌株进行18S rDNA鉴定。1.7 氮源对产酯的影响 分别以酵母膏、尿素、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4等作为摇瓶培养基的唯一氮源，在发酵培养基中接入高产菌株的斜面菌种，在28 C、200 rpm的条件下发酵24 h，检测酯类的产量，根据测定结果优选氮源。1.8 发酵条件对产酯的影响 以1.7中优选所得的氮源为唯一氮源，配制培养基，接入高产菌株的斜面菌种，分

11、别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行发酵，检测酯类的产量。1.9 盐度对产酯的影响 在1.7和1.8的实验基础上，将不同用量的氯化钠添加至培养基中，经摇瓶发酵，检测酯类的产量。2 结果与讨论2.1 产酯菌株的筛选 从平板中挑取了82个单菌落，经摇瓶发酵筛选，获得产酯菌株7株，总酯的产量如图1所示。7株菌总酯产量的范围为0.653.87 g/L，其中，菌株DZ-3的产量最高。王旭亮等从清香型酒醅中筛选获得一株异常毕赤酵母Ac-19，该菌发酵4 d的总酯产量约为1.572 g/L9。宋韡等利用从汾酒大曲中分离获得的异常汉逊酵母NZ-19-1，在优化条件下发酵7 d，产酯量达到2.9 g/L10

12、。与文献报道的产酯率相比，菌株DZ-3具有较高的产酯能力，故被选为进一步研究的菌株。图1 7株菌株的总酯产量Fig. 1 Total ester yield produced form 7 strains2.2 酯类的GC-MS分析 采用气相色谱质谱联用仪对菌株DZ-3发酵液的馏出液进行分析，各组分的GC-MS图谱如图2所示。图2中主要存在3个峰，第一个峰（2.769 min）对应的组分是乙酸乙酯，第二个峰（3.462 min） 对应的组分是乙醇，第三个峰（6.975 min） 对应的组分是水。经GCMS分析，菌株DZ-3所产的酯类物质以乙酸乙酯为主，其产量为3.84 g/L，与总酯测定的结果

13、十分接近。图2 菌株DZ-3酯类产物的GC-MSFig. 2 GC-MS spectrum of ester product derived from strain DZ-32.3 菌种DZ-3的鉴定 菌种DZ-3在平板培养基上的菌落呈白色、圆形、中央凸起、边缘整齐。通过载片培养物制作和显微镜观察，并采用扫描电镜观察与摄像，扫描电镜（5000） 下的菌体形态如图3所示，发现菌体呈椭圆形，有假菌丝和子囊孢子的形成。部分生理生化试验项目的结果如表1所示，菌种DZ-3可利用葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖进行发酵，可利用硝酸盐作为唯一氮源，可分解利用尿素，不能产生胞外类淀粉多糖。通过对菌种DZ-3的18S

14、 rDNA进行PCR扩增，获得1762 bp的序列，在NCBI中利用BLAST程序与数据库的序列进行比对，发现菌种DZ-3与Trichosporon cutaneum SJH05 （登录号: EF114682.1）的亲缘关系最为接近，它们的同源性达99%。利用软件MEGA5.2以Neighbor-joining法对菌种DZ-3构建系统发育树，如图4所示。根据菌种DZ-3的形态特征、部分生理生化特征以及18S rDNA分子生物学特征，可确定它为皮状丝胞酵母（Trichosporon cutaneum）。图3 菌种DZ-3在扫描电镜（5000）下的形态Fig.3 SEM photographs of cell morphology of strain DZ-3 （5000）表1 生理生化试验情况Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain DZ-3试验项目结果葡萄糖发酵果糖发酵麦芽糖发酵蔗糖发酵硝酸盐利用产类淀粉物质脲酶试验+-注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。图4 菌种DZ-3的系统发育树Fig.4 The sequence phylogenetic