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1、生化实验教材电子版生化实验教材电子版 生物化学实验指导 电子版 实验一 糖类的颜色反应 . 3 实验二 糖类的还原作用 . 4 实验三 蛋白质的颜色反应 . 6 实验四 蛋白质的沉淀反应 . 9 实验五 蛋白质等电点测定 . 11 实验六 酪蛋白的制备等电点沉淀法 . 12 实验七 氨基酸的纸层析 . 14 实验八 电泳技术纸电泳分离氨基酸 . 16 实验九 酶的催化特性 . 20 实验十 糖化酶活力测定 . 23 实验十一 从酵母提取核糖核酸稀碱法 . 25 实验十二 从酵母提取核糖核酸浓盐法 . 26 实验十三 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 . 28 实验十四 醋酸纤维薄膜电泳 . 29

2、实验一 糖类的颜色反应 一、实验目的 1了解糖类某些颜色反应的原理。 2学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、实验原理 1.-萘酚反应（Molisch 反应）原理 糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与 -萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2.间苯二酚反应（Seliwanoff 反应）原理 在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。

3、三、 器材 1.试管及试管架 2.滴管 3.水浴锅 四、 试剂 1.莫氏（Molisch）试剂： 5% -萘酚的酒精溶液，称取 -萘酚 5g，溶于 95%酒精中，并用此酒精使总体积达 100mL，贮于棕色瓶内。此试剂需新鲜配制。 2.塞氏（Seliwanoff）试剂：称取间苯二酚 0.05g 溶于 30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至 100 mL，此试剂需新鲜配制。 3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 4.1%果糖溶液：称取果糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 5.1%蔗糖溶液：称取蔗糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 6.1%淀粉溶液：称取可溶性淀

4、粉 1g 与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至 100mL。 7.0.1%糠醛溶液：称取糠醛 0.1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 8.浓硫酸 500mL 五、 操作 1.-萘酚反应（Molisch 反应） 取 5 支试管，分别加入 1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、 0.1%糠醛溶液各 1.5mL。再向 5 支试管中各加入 2 滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约 1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二液分界处有紫红色环出现。观察、记录各管颜色。 试剂 现象 解释现象 1%葡萄糖

5、溶液 1%果糖溶液 1%蔗糖溶液 1%淀粉溶液 0.1%糠醛溶液 2.间苯二酚反应（Seliwanoff 反应） 取 3 支试管，分别加入 1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各 5mL。再向各管分别加入塞氏试剂 2mL，混匀。将 3 支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。 六、思考题 1可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？ 2-萘酚反应的原理是什么？ 实验二 糖类的还原作用 一、实验目的 学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。 二、实验原理 许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱性溶液中能将铜、铋、汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧

6、化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。 本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是含Cu 2+ 的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色或黄色的 Cu 2 O 沉淀。生成 Cu 2 O 沉淀的颜色之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄色，越大则呈红色。如有保护性胶体存在时，常生成黄色沉淀。 三、器材 1试管及试管架 2竹试管夹 3水浴锅 4电炉 四、试剂 1斐林（Fehling）试剂 菲林甲液（硫酸酮溶液）：称取 34.5g 硫酸铜（CuSO 4 5H 2 O）溶于 500mL 蒸馏水中。 菲

7、林乙液（碱性酒石酸盐溶液）：称取 125g 氢氧化钠和 137g 洒石酸钾钠溶于 500 mL蒸馏水中。 为了避免变质，甲、乙二液分开保存。用前，将甲、乙二液等量混合即可。 2本尼迪克特（Benedict）试剂 称取柠檬酸钠 173g 及碳酸钠（Na 2 CO 3 H 2 O）100 g 加入 600mL 蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释至 850mL。 另称取 17.3g 硫酸铜溶解于 100 mL 热蒸馏水中，冷却，稀释至 150mL。 最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可 _使用。 31%葡萄糖溶液：称取葡萄糖 1g，溶于

8、 100mL 蒸馏水中。 41%果糖溶液：称取果糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 51%蔗糖溶液：称取蔗糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 61%麦芽糖溶液：称取麦芽糖 1g，溶于 100mL 蒸馏水中。 71%淀粉溶液：称取可溶性淀粉 1g 与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至 100mL。 五、操作 先取 1 支试管加入斐林试剂约 1mL，再加入 4 mL 蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能使用。经检验，试剂合格后，再进行下述实验。 取 5 支试管，分别加入菲林甲、乙液各 1 mL，再向各试管分别加入 1葡萄糖溶液、1

9、果糖溶液、1蔗糖溶液、1麦芽糖溶液、1淀粉溶液各 1mL。置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却。观察各管溶液的变化。 另取 6 支试管，用本尼迪克特试剂（每管加 2mL）重复上述实验。 比较两种方法的结果。 斐林氏与本尼迪克特试法： 1%葡萄糖溶液 1%果糖溶液 1%蔗糖溶液 1%麦芽糖溶液 1%淀粉溶液 斐林氏试剂 本尼迪克试剂 试解释以上表格现象： 六、思考题 1斐林氏、本尼迪克特试剂法检验糖的原理是什么？ 2你熟悉的糖中那些具有还原性？ 实验三 蛋白质的颜色反应 一、实验目的 熟悉一些常见蛋白质的颜色反应 二、实验原理 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含

10、氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜色反应有： 1. 双缩脲反应 将尿素加热到 180，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在 540 _ 处比色，定量测定蛋白质。 2. 蛋白质的黄色反应 黄色反应是含有芳香族氨

11、基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。 3. 米伦氏反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。 4. 茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及 -氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应

12、 三、器材 试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。 四、 试剂 1. 卵清蛋白液：将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释 2040 倍，23 层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 0.5%苯酚溶液：苯酚 0.5mL，加蒸馏水稀释至 100mL。 3. 1%白明胶液：1g 白明胶溶于少量热水，完全溶解后，稀释至 100mL。 4. 米伦(Millon)试剂：40g 汞溶于 60mL 浓硝酸(比重 1.42)，水浴加温助溶，溶解后加2 倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可 _保存。 5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于 95%乙醇并稀释至 100mL。 6

13、.浓硝酸：比重 1.42。 7. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜 1g 溶于蒸馏水中，稀释至 100mL。 8. 尿素：如颗粒较粗，最好研磨成粉末状。 9. 10%氢氧化钠溶液：氢氧化难 10g 溶于蒸馏水，稀释至 100mL。 五、操作方法 1. 双缩脲反应 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加 10%NaOH 溶液 1mL 混匀，观察有无紫色出现。 另取一试管，加蛋白质溶液 10 滴，再加 10% NaOH 溶液 10 滴及 1%CuSO 4 溶液 4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 注意事项：硫

14、酸铜不能多加，否则将产生蓝色的 Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子 Cu(NH 3 ) 4 2+ ，妨碍此颜色反应的观察。 2. 蛋白质的黄色反应 在一试管内，加蛋白质溶液 10 滴及浓硝酸 34 滴，加热，冷却后再加 10%NaOH 溶液 5 滴，观察颜色反应。 3. 米伦氏反应 用苯酚做实验：取 0.5%苯酚溶液 1mL 于试管中，加米伦试剂约 0.5mL(米伦试剂含有硝酸，如加入量过多，能使蛋白质呈黄色，加入量不超过试液体积的 1/51/4)，小心加热，溶液即出现玫瑰红色。 用蛋白质溶液做实验：取 2mL 蛋白质溶液，加 0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白

15、质的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故)，小心加热，凝固之蛋白质出现红色。 注意事项：蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，如此试剂不能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有 H 2 O 2 、醇或碱，因它们能使试剂中的汞变成氧化汞沉淀。遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和。 4. 茚三酮反应 取 1mL 蛋白质溶液置于试管中，加 2 滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意：此反应必须在 pH57 进行)。 六、 思考题 1. 氨基酸与蛋白质具有哪些共同的颜色反应？说明原因。 2. 蛋白质除了可以实验中的这些颜色反应外，你还知道哪些蛋白质的颜色反应？ 实验四 蛋白质的沉淀

16、反应 一、实验目的 加深对蛋白质的沉淀反应的认识，理解蛋白质沉淀反应的原理。 二、实验原理 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH 3 + ，COO-，SH，CONH 2 等，和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。 蛋白质由于带有电荷和水膜，因

17、此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀： 1. 加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。 2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产

18、生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。 3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。 4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。 用盐析法或低温下加入丙酮、乙醇使蛋白质沉淀，以及利用等电点的沉淀反应时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的生物活性。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀

19、作用称为可逆沉淀作用。但如在温度较高情况下加入有机溶剂来沉淀分离蛋白质或已用有机溶剂沉淀分离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开，都会引起蛋白质的性质发生改变，这应该注意。 三、器材 试管及试管架、吸管、抽滤瓶、量筒、布氏漏斗。 四、试剂 1. 蛋白质氯化钠溶液取 20mL 蛋清，加蒸馏水 200mL 和饱和氯化钠溶液 100mL，充分搅匀后纱布滤去不溶物(加氯化钠的目的是溶解球蛋白)。 2. 蛋白质溶液 取 5mL 蛋清，用蒸馏水稀释至 100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。 3. 饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵 850g 加于 1000mL 蒸馏水中，在 7080下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出

20、白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 4. 饱和苦味酸溶液：取 2g 苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水 100mL，80水浴约 10min 使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此液可存放数年。 5. 1%醋酸溶液、1%醋酸铅溶液、1%硫酸铜溶液、1%三氯乙酸溶液。 6. 0.5%磺基水杨酸溶液。 7. 5%鞣酸溶液。 8. 硫酸铵粉末。 五、操作 1.盐析作用：取 1 支试管加入 3mL 蛋白质氯化钠溶液和 3mL 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约 10min，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为

21、清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 2.乙醇沉淀蛋白质：取 1 支试管架蛋白质溶液 1mL，加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入 95%乙醇 2mL 混匀。观察有无沉淀析出。 3.有机酸沉淀蛋白质：取 2 支试管，各加入蛋白质溶液约 0.5mL，然后分别滴加 10%三氯乙酸和 0.5%磺基水杨酸数滴。观察蛋白质沉淀。 4.重金属盐沉淀蛋白质取：2 支试管各加蛋白质溶液 2mL，一管内滴加 1%醋酸铅溶液，另一管内滴加 1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。 5.生物碱试剂沉淀蛋白质取：2 支试管，各加蛋白溶液 2mL 及 1%醋酸 45 滴。其中 一管滴加 5%鞣酸，另一管滴加饱

22、和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。 六、思考题 1.蛋白质的中性盐沉淀和重金属沉淀有何差别？各有什么用途？ 2. _鸡蛋清可作为铅或汞中毒的解毒剂？ 实验五 蛋白质等电点测定 一、实验目的 掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。 了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。 二、实验原理 蛋白质同氨基酸一样，是两性电解质，在不同的 pH 水溶液中解离后所带正、负电荷不同。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态出现，在电场内该蛋白质分子既不向阴极 _，也不向阳极 _，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。 各种蛋白质具有特定的等电点，这时

23、和它所含的氨基酸的种类和数量有关。如蛋白质分子中含碱性氨基酸较多，其等电点偏碱。例如从雄性鱼类成熟 _中提取的鱼精蛋白含精氨酸特多，其等电点为 12.012.4。如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多，则其等电点偏酸。例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为 37 个，而碱性氨基酸残基仅含 6 个，其等电点为1.0 左右。含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点大多为中性偏酸，约 5.0左右。 蛋白质等电点多接近于 pH7.0，略偏酸性的等电点也较多。处于等电点的蛋白质表现电中性，所以在溶液中的稳定性很低，容易沉淀析出。将酪蛋白溶液分置于连续不同的 pH 环境中，通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。

24、三、器材 试管和试管架、滴管、吸管(1 和 5mL)、容量瓶。 四、试剂 1. 酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白 0.25g，加蒸馏水 20mL 及 1.00mol/L 氢氧化钠溶液 5mL(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加 1.00mol/L 醋酸 5mL(必须准确)，倒入50mL 容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果酪蛋白溶于 0.10mol/L 醋酸钠溶液内，其浓度为 0.5%。 2. 0.01mol/L 醋酸溶液 3. 1.00mol/L 醋酸溶液 4. 0.10mol/L 醋酸溶液 5. 1.00mol/L 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸的浓度要标定） 五、操作 1.取 9 支粗

25、细相近的干燥试管，编好号后按表 5-1 的顺序准确地加入各种试剂。 2.加完后观察上述各管的混浊程度，静置约 20min，再视其沉淀情况，以-，+，+，+，+符号表示沉淀的多少。根据观察的结果，指出哪一个 pH 是酪蛋白的等电点(混浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的 pH 值，即为酪蛋白的等电点)。 3. 该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应该严格按照定量分析的操作进行。为了保证实验的重复性或为了进行大批 量的测定，可以事先按照上述的比例配制成大量的 9 种不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确吸取 4mL 该溶液，再各加入 1mL 酪蛋白

26、醋酸钠溶液。 表 5-1 试剂加入及数据记录表 管号 酪蛋白醋酸钠溶液（毫升） 水 （毫升） 0.01mol/L醋酸 （毫升） 0.10mol/L醋酸 （毫升） 1.00mol/L醋酸 （毫升） pH 观察沉淀出现情况 0 分钟 10 分钟 20 分钟 1 1 8.38 0.62 5.9 2 1 7.75 1.25 5.6 3 1 8.75 0.25 5.3 4 1 8.50 0.50 5.0 5 1 8.00 1.00 4.7 6 1 7.00 2.00 4.4 7 1 5.00 4.00 4.1 8 1 1.00 8.00 3.8 9 1 7.40 1.60 3.5 六、思考题 1.该方法

27、测定蛋白质等电点的原理是什么？ 2.蛋白质等电点在实际生产上有何意义？ 实验六 酪蛋白的制备 等电点沉淀法 一、实验目的 1、了解等电点沉淀法 2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法 3、加深对蛋白质等电点性质的理解 二、实验原理 蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，在一定 pH 溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的 pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时 溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为 4.7。将牛乳的 pH 调至 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。 但单独利用等电