雷洛昔芬与游泳运动对.docx

1、雷洛昔芬与游泳运动对雷洛昔芬与游泳运动对去势大鼠骨生物力学指标影响的研究目的 通过建立SD大鼠右侧后肢的去神经模型，并对其施以被动运动与电刺激的干预；观察其对大鼠骨代谢的影响。分析被动运动与电刺激对去神经大鼠骨组织NGF mRNA表达的影响，探讨非药物防治废用性骨质疏松的有效手段及其的机理。 方法 2月龄的SD雌性大鼠50只，适应性饲养7日后，逐一称重，按体重随机分为假手术组(Sham)；坐骨神经切除组（DN）；被动运动组（PM）；电刺激组（ES）；联合干预组 (PM+ES)。Sham组行假手术（Sham组与其余四组手术路径相同，但不切除坐骨神经与股神经。）DN.PM.ES.PM+ES组大鼠均

2、行坐骨神经及股神经切断术（神经切断5mm）。 手术后48小时，PM；PM+ES组开始作被动运动。ES； PM+ES组开始作电刺激治疗。30天后，各组大鼠股动脉取血处死，；用REST（relative expression software tool）进行分析比较。结果结论 关键词：废用性骨质疏松；游泳；1. 前言废用性骨质疏松症（Disuse Osteoporosis，DOP）属于继发性骨质疏松，其定意为由于肌肉不活动和负重减少引起的骨量丢失，依原因和环境因素不同可影响整个或部分骨骼系统2 。目前，对废用性骨质疏松症的防治研究 。而临床上多以按摩预防废用性骨质疏松（如长期卧床休养、骨折后固定等

3、原因引起的骨质疏松）3 的发生。虽然废用性骨质疏松症的决定因素尚有争论。但制动可以导致或加速骨质疏松的发生；而运动可以减缓或避免骨质疏松的发生确是客观存在的。DOP不同于老年代谢性骨质疏松症，多见于青壮年，由于骨折不愈合或感染后长期不能使用肢体所致，患者不仅丧失劳动能力，且给进一步治疗带来极大困难。废用性骨质疏松还会引起一系列并发症，如肾结石发病率增高、关节周围软组织骨化、肢体畸形以及病理性骨折发病率增高等，6 且DOP 具有相对的隐蔽性，往往为患者所忽视而产生较为严重的后果。这不仅给患者带来了巨大的身心痛苦；也给家庭带来沉重的经济负担。在一定程度上已成为一种社会问题，将大大影响我国精神文明和

4、物质文明的建设。对废用性骨质疏松的治疗目前尚无理想方法。本试验通过切断大鼠坐骨神经，建立废用性骨质疏松的动物模型，并采用水中运动与摄入木脂素相结合的方法对废用性骨质疏松的形成进行干预；通过对大鼠生理学、分子生物学的检测分析。探讨NGF在废用性骨质疏松形成中的影响地位及预防过程的作用机理；分析按摩与 。 2.实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验药品蒸馏水、0.9生理盐水、75酒精、碘伏消毒液、青霉素80万u、3%戊巴比妥钠、手术器械消毒液、3戊二醛、醋酸异戊脂、100%酒精、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、3的稀盐酸、血清钙Ca 、血清磷P、血清酸性磷酸酶ACP试剂盒（美国

5、RANDOX公司）、己烯雌酚（江西南昌制药厂，赣卫药准字（1996）第020038号）、血清雌二醇E2试剂盒（北京福瑞公司）、血清骨钙素BGP试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）、血清抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP(南京建成生物工程研究所) 、中药材（成都中医药大学附院）。2.1.2实验器材2.1.2.1动物实验室器材动物实验房、标准大鼠饲养笼10个、电暖器2个、温度计1个、电子称（DS-671型，上海产）1台、低温冰箱（-20）1台、小动物跑台1台（天津产）。2.1.2.2造模和取材器材小动物手术台4台、鼠夹4个、手术器械（刀柄1把，解剖剪2把，无齿镊1把，有齿镊1把，小号止血钳2把，刀片若干

6、，持针器1把，小三角针若干枚，羊肠缝线若干）4套、托盘1个（器械消毒）、无菌纱布若干、消毒手套10付、消毒洞巾60张、无菌棉签若干包、0.5ml注射器60个、烧杯4个；100ml、50ml量筒各1个、试管架4个、10ml无菌试管（一次性，带盖）若干、离心管若干、离心机1台（上海手术器械厂 80-2型台式低速）。2.1.2.3中药制作和灌胃器材玻璃棒1个、药罐1个、漏斗1个、消毒500ml盐水瓶4个、1000w电炉1个、5ml大鼠灌胃器2个。2.1.2.3各项指标检测器材50l、100l移液器各1个、移液器头若干、分析天平（TG3288型，湘仪天平仪器厂）、电子恒温水沐锅、752紫外光分光光度计

7、（上海精密科学仪器有限公司）、OLYMPUS AU5400型全自动生化分析仪、数码照相机1部、扫描电镜1台（AmRay1000B型，美国）、INSTRON万能材料试验机（4302型，Instron Co.英，力学自带软件INSTRON SERIES）。2.1.3实验动物3月龄SD雌性大鼠60只，SPF级（无特定病原体动物），体重24810g，由四川大学华西医学院实验动物中心提供。2.2实验方法2.2.1动物喂养标准啮齿目动物饲养笼分笼喂养，每笼不超过6只，自由摄食饮水，大鼠饲料为国家标准固体混合饲料，由四川大学华西医学院实验动物中心提供。保证通风条件良好，控制室温在21-25，室内空气流通，光

8、照时间为12h/d左右。2.2.2动物分组将购回的60只SD大鼠适应性饲养3日后，逐一称重，随机分为5组，每组12只：假手术组（SHAM），与以下四组手术路径相同，但不切除卵巢，每天灌胃与服药组药物等量的蒸馏水；模型组（OVX），做卵巢切除手术，但不作其他处理，同样灌胃与服药组药物等量的蒸馏水；己烯雌酚组(DES)，将己烯雌酚用双蒸水配制成溶液，每只0.1mg.kg-1.d-1灌胃；骨松宁组（GSN），手术一周起开始中药灌胃；骨松宁组结合运动组（GSNE），手术一周后开始运动，服药情况同骨松宁组。2.2.3动物造模20-21适应性喂养一周后，对模型组、己烯雌酚组、骨松宁组、骨松宁结合运动组SD

9、大鼠进行双侧去卵巢手术造模，具体操作方法如下：2%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射，麻醉满意后，取大鼠俯卧位，手术区剃毛，碘伏消毒，铺洞巾。在大鼠髂脊顶部上方1cm处左右做纵行切口，长约0.5cm，打开后腹膜。由于卵巢为粉红色颗粒状组织，被周围脂肪组织所掩盖，提起后用丝线结扎卵巢周围相连组织，然后将其切除。用5个0的丝线间断缝合切口，医用酒精纱布包扎切口。术后腹腔注射青霉素（2.7万u/kg）2次，以预防感染。每天用酒精棉球擦拭伤口，直至伤口愈合。假手术组大鼠按照上面的手术方法，打开腹膜后，不做卵巢切除手术，其他步骤一样。2.2.4动物运动的设置22骨松宁结合运动组在手术一周后开始跑台训练

10、。开始跑速12m/min，持续时间20min，跑台倾斜角0度。隔日增加强度3m/min至18m/min,第二周起在稳定跑进速度的基础之上，将持续时间控制在50min，5d/w。每次训练时，前10分钟强度为15 m/min，后40分钟强度为18m/min。持续12周结束。2.2.5木脂素2.2.6木脂素灌胃以5ml的大鼠灌胃器抽取复方中药煎剂3.6ml。左手固定动物，右手持针，把灌胃针头前端放进大鼠口腔，顺着上腭部插入咽部，灌胃针头前端通过喉部后有抵触感，继续插入，进入到食管，当大鼠出现呕吐反应后，下插灌胃针头至胃并推注中药。在整个实验期间，未伤及大鼠口腔、咽喉、食管和气管等器官，无药液误入气管

11、现象出现。 2.2.8生物力学标本的采集、制作及测定大鼠取血后，分别剥取左右股骨和第1-3腰椎(L1-3)，剔除上面附着的肌肉和结缔组织，其中腰椎要去除左右棘突，用浸透生理盐水的纱布包好20保存。在做腰椎的压缩实验前，用扫描仪扫描腰椎横截面，在sport hospital 1.0软件上计算腰椎横截面积。股骨的横截面积是在做完三点弯曲实验后，放在15的稀盐酸中脱钙3小时，然后用刮胡刀片修齐断端，再用扫描仪扫描其横截面，最后在sport hospital 1.0软件上计算股骨横截面积。生物力学指标测试时，将标本自低温-20冰箱的环境中取出，室温下自然解冻，然后放在INSTRON万能材料试验机上进行

12、股骨三点弯曲和腰椎压缩实验，所有数据均有机器自带软件（Series IX Automated Materials Testing system）自动记录，记录频率为10次/秒，加载速率为2mm/min，跨距25mm。2.2.10生物化学指标的测定各项生化指标除血清抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP采用722分光光度计测定外，其余均采用OLYMPUS AU5400型全自动生化分析仪测定。2.3数据处理所得数据均用spss11.5软件分析处理，所有数据结果均以xs(均数标准差)的方式表示。组间的两两比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐性时，用LSD复选项进行多重比较，对误差率不进行

13、调整；当方差不具有齐性时，用Tamhane,s T2法复选项进行各组均值多重比较，检验水准取双侧0.05。显著性差异水平为p0.05，非常显著性差异水平为p0.01。3.结果3.1生物力学指标的变化3.1.1各组大鼠左侧股骨结构力学各参数的比较Tab 1. Comparison of structure mechanics parametrers of left thighbone between the groups组别(数目)弹性载荷(N)弹性挠度(mm)最大载荷(N)最大挠度(mm)SHAM(12)91.8523.510.650.06163.1122.900.820.08OVX(10)

14、81.9110.940.550.15100.368.300.720.09GSN(12)92.8319.900.550.05127.5711.450.730.11GSNE(12)98.6610.540.580.18158.5018.460.790.21 DES(10)92.5612.690.640.14154.0512.500.900.19和OVX相比，P0.05，P0.01；Compare to OVX: P0.05，P0.01；和GSN相比，P0.05，P0.01。Compare to GSN: P0.05，P0.01.3.1.2各组大鼠左侧股骨材料力学各参数的比较 Tab 2. Compa

15、rison of material mechanics parametrers of left thighbone between the groups组别(数目)弹性应力（N/mm2）最大应力（N/mm2）弹性模量（N/mm2）SHAM(12)129.2233.00198.5250.1010373.685451.70OVX(10)113.0068.84150.7568.986788.473117.65GSN(12)138.3355.09150.7160.008484.612574.41GSNE(12)175.5563.07206.6776.0010283.676040.45 DES(10)1

16、17.6552.10188.2066.276777.252557.72和OVX相比，P0.05，P0.01；Compare to OVX: P0.05，P0.01；和GSN相比，P0.05，P0.01；Compare to GSN: P0.05，P0.01；和GSNE相比，P0.05，P0.01； Compare to GSNE: P0.05，P0.01；和DES 相比，P0.05，P0.01。 Compare to DES: P0.05，P0.01.3.1.3各组大鼠腰椎结构力学及材料力学参数的比较Tab 3. Comparison of structure mechanics and ma

17、terial mechanics parametrers of lumbar between the groups组别(数目)最大应力(N/mm2)最大挠度(mm)最大载荷(N)SHAM(12)12.186.872.030.33303.2640.91OVX(10)4.723.121.270.25120.7864.47GSN(12)9.262.321.420.14187.5711.47GSNE(12)10.461.881.660.31228.4918.46 DES(10)10.704.681.900.43250.66106.87和OVX相比，P0.05，P0.01； Compare to OVX

18、: P0.05，P0.01；和GSN相比，P0.05，P0.01； Compare to GSN: P0.05，P0.01；和GSNE相比，P0.05，P0.01； Compare to GSNE: P0.05，P0.01；和DES 相比，P0.05，P0.01。 Compare to DES: P0.05，P0.01.由Tab 1可知：各组大鼠间股骨弹性载荷没有显著性差异；在股骨最大载荷方面，SHAM、GSNE和DES与OVX相比均具有非常显著性差异(P0.01)，GSN与OVX间有显著性差异(P0.05)。SHAM、GSNE和GSN相比也具有显著性差异(P0.05)。SHAM、GSNE和D

19、ES间无显著性差异。由Tab 2可知：各组大鼠在股骨弹性挠度和股骨最大挠度方面均无显著性差异。由Tab 2可知：在弹性应力方面，GSNE与SHAM、OVX及DES相比均具有非常显著性差异(P0.01)，SHAM、OVX及DES间无差异。GSN与OVX间及GSNE与GSN间也具有显著性差异(P0.05)。在股骨最大应力方面，相对OVX及GSN，SHAM、GSNE和DES均与它们有显著性差异(P0.05)，而三者之间无差异。在股骨弹性模量方面，SHAM和GSNE均与OVX及DES有显著性差异(P0.05)，而SHAM和GSNE间无差异， OVX、DES和GSN间亦无差异。由Tab 3可知：在腰椎最

20、大载荷方面，与OVX相比，其它各组均与之有非常显著性差异(P0.01)。GSN和GSNE与SHAM相比，有非常显著性差异(P0.01)，DES与SHAM相比有显著性差异(P0.05)。GSNE和DES与GSN相比也具有显著性差异(P0.05)，而二者之间无差异。在腰椎最大挠度方面，和OVX相比，SHAM、GSNE和DES与之有非常显著性差异(P0.01)，GSN与之有显著性差异(P0.05)。和GSN相比，SHAM和DES均与之有非常显著性差异(P0.01)。和GSNE相比，SHAM与之有显著性差异(P0.05)，而DES与之无差异。SHAM和DES间无差异。在腰椎最大应力方面，与OVX相比，

21、SHAM、GSNE和DES均与之有非常显著性差异(P0.01)，而三者之间无差异。GSN与OVX及SHAM与GSN间也有显著性差异(P0.05)。4讨论4.1生物力学指标的相关分析骨形态计量学目前仍然是各种代谢性疾病的诊断和研究的最有效方法，也是药效学研究的“黄金标准”；骨生物力学是检测骨骼功能改变的量化指标，也是评价骨质疏松的一个重要指标26。近年来，已有不少学者提出骨质疏松时骨量的减少与骨结构的改变均可直接影响骨的生物力学性能，使骨的力学强度降低27。又有研究表明28，生物力学的测定能发现骨质量的改善，此时双能X线测量结果常没有明显改变。因此，骨生物力学与骨组织形态学结合一起,可全面反映骨

22、生理、病理与功能变化，从而可以对骨的质量做出科学的判断，为合理评价骨质疏松或新药研究的药效指标提供理论依据。 4.2.2 生物力学指标的相关分析力学因素与骨代谢的研究表明29，外力作用于骨组织时，可使骨组织产生相应的应变，而骨细胞可感受到其周围应变的大小与变化，并将力学信号转化为生物学信息，反馈性地调节骨代谢，以改变局部的骨量与骨强度，适应或满足局部力学功能的需要。应力、应变大的部位，骨量与骨强度大；应力、应变小的部位，骨量与骨强度也小，即骨组织遵守Wolf定律。骨生物力学的基本特性包括骨的材料特性和结构特性29。骨的材料特性由组成骨组织的几何构造特点所决定，包括骨材料的质量和数量，反映骨自身

23、的强度和韧性，与骨中矿物质含量、骨密度有关。常用指标有弹性应力(弹性限度内骨标本受力截面单位面积上受到的最大载荷)、最大应力(最大载荷作用下骨标本受力截面单位面积上受到的载荷)和骨弹性模量(弹性应变区的斜率，表示材料抗形变的能力, 反映骨的构成材料的质量和性能)等；骨的结构特性包括骨材料的几何分布及微结构的完整程度，反映整体骨抵抗骨折的能力。常用指标有弹性挠度(骨标本在弹性限度内产生的最大变形)、最大挠度(骨标本在最大载荷下产生的变形)、弹性载荷(骨骼在弹性变形阶段所承受的最大载荷)和最大载荷(骨骼所承受的极限载荷)等。骨结构力学和材料力学各生物力学指标检测结果表明，去卵巢大鼠骨的结构和材料力

24、学性能参数均有不同程度的下降；而相对于模型组，治疗各组对大鼠股骨的弹性载荷、弹性挠度、最大挠度均无明显影响；但对大鼠股骨最大载荷、弹性应力、最大应力、弹性模量及腰椎各指标上，相对与模型组均有明显的提高作用。其中，骨松宁结合运动组在提高股骨弹性应力和弹性模量方面显著型优于己希雌酚组，在提高股骨最大载荷、弹性应力、最大应力和腰椎最大载荷方面也优于骨松宁组。最大载荷、弹性应力和最大应力结果的明显提高表明，骨松宁结合运动使去卵巢大鼠骨骼的韧性、抗挤压和抵抗破坏的能力加强了，而且比单纯的骨松宁合剂效果更好。已有资料表明30,31,骨的微细结构包括空间微细结构的细微变化或破坏(比如显微骨折、骨小梁减少或变

25、薄及其空间结构的改变等)以及骨的构成成分的改变(如骨盐的丢失),骨胶原空间结构的改变和性能的下降等也是导致骨的力学性能下降的重要因素。去卵巢大鼠骨的弹性模量的变化提高反映了骨构成材料质量的改善，说明骨松宁结合运动可以提高去卵巢大鼠骨构成材料的质量。我们推测,弹性模量的提高可能与改善骨的细微结构包括空间结构的细微变化、骨的构成成分的改变和骨胶原纤维性能的改变有关。此次实验的结果也显示，骨松宁结合运动对去卵巢大鼠骨骼力学性能的影响，主要表现在材料力学性能的提高，而在去卵巢大鼠股骨结构力学方面，虽然实验各组与模型组相比，弹性载荷、弹性挠度、最大挠度等指标都有所提高，但并无统计学意义。以上力学各参数说

26、明，骨松宁结合运动可有效改善去卵巢大鼠的骨质量，并通过调节骨中阴柔的胶原与阳刚的骨矿在“质”与“量”上的协调统一，达到提高骨骼力学性能的目的，因此用该手段来提高绝经后骨质疏松的骨质量是切实可行的。4.7绝经后骨质疏松症模型的选择由于绝经后骨质疏松病因复杂，确切机制至今仍未明确，但各国学者一致认为，妇女在自然或人工绝经后，卵巢功能退化，雌激素不足是女性骨质疏松发生的一个重要危险因素，补充雌激素可以预防与女性有关的骨质丢失。因此自1941年Albright首先将骨质疏松列为临床疾病以来，研究人员利用各种动物模型,模拟妇女绝经后生理状态，探讨在雌激素分泌不足情况下，骨形态发生的变化，以及各种反映骨代

27、谢指标的变化54-55。建造绝经后骨质疏松的模型主要有两类：手术切除动物双侧卵巢；非手术给予药物，常用药物有：buserelin(一种促黄体素分泌激素的类似物，有降低血清雌二醇含量的作用)、Casodex(一种非甾体类雄激素拮抗剂，可使体内雌二醇耗竭)、GnRH(促性腺激素分泌激素，可以造成骨质丢失)等。双侧卵巢切除模型，于1969年由Saville首先建立，后被反复证实与实用，现在已成为研究绝经后骨质疏松的经典模型。选择成年雌性SD大鼠作为实验动物有以下几点原因56-57：大鼠卵巢切除以后，血清雌二醇含量明显下降，子宫重量显著减轻，骨代谢活跃，骨转换增强，骨吸收大于骨形成。起初有一个快速的以

28、松质骨丢失为主的阶段，松质骨的骨量减少，骨强度下降，较好的模仿了人正常绝经后高转换型骨质疏松发生的骨丢失。大鼠骨骼系统解剖与人类有众多的相似之处，如股骨颈近端无骨膜覆盖等。去卵巢大鼠在骨质疏松骨折和骨量减少的部位上也表现出了与人类很大的相似性。一些人类适用的常规检测方法，如生化标志物、骨密度、组织形态学和生物力学测试等都可以适用于大鼠。综上，双侧卵巢切除模型与绝经后妇女骨质疏松的变化类似，所以常用于研究绝经后骨质疏松的发病机制、防治及相关问题。4.9复方中药的相关探讨4.10实验方法的选择及中药与运动结合的意义目前，研究传统中药对于绝经后骨质疏松症防治效果已成为国内外专家学者的一大热点，不论在

29、是在辨证论治、专方专治还是在综合治疗方面，都取得了很大进展，新方新药层出不穷。但对于传统中药与运动相结合的研究至今仍未见报道，为了探讨传统中药能否在运动前提下得到更好的效果，本实验率先研究了中药骨松宁合剂结合运动对于去卵巢大鼠骨质疏松的防治效果。研究结果表明，骨松宁结合运动组大鼠在骨形态学、生物力学、生化等大多指标方面均优于骨松宁组，而己烯雌酚组也并没有显示出比骨松宁结合运动组显著的优越性，其中在提高去卵巢大鼠股骨弹性应力和弹性模量方面，骨松宁结合运动组还显示出了比己烯雌酚组更加明显的优越性。骨松宁合剂在补肾填精的基础上，兼顾健脾益气、活血化淤之法，采用阴阳双补，化生精血，以后天养先天之法，补

30、充肾气肾精，来达到强筋壮骨的目的。以上结果从“以药测证”的角度，证明了骨松宁合剂确实具有补肾生髓长骨之功效，也充分说明了祖国医学中“肾主骨”理论的科学性及利用补肾类药物防治绝经后骨质疏松的可行性。该方通过对机体各器官的整体调节，并结合运动对骨骼产生的机械应力刺激，骨骼附近血流的改善等作用，使骨松宁合剂的防治效果发挥的更好，从而恢复去卵巢大鼠机体内的骨吸收和骨形成之间的动态平衡，有效提高了去卵巢大鼠骨骼的生物力学性能，从而达到防治绝经后骨质疏松的作用。骨松宁合剂结合运动有效防治去卵巢大鼠绝经后骨质疏松的可能机理为：较强的类雌激素样作用。本实验表明，骨松宁合剂结合运动表现出了更加有效的提高去卵巢大

31、鼠血中E2水平和子宫系数， 而单纯的服用骨松宁合剂虽然也可使去卵巢大鼠血中E2水平和子宫系数升高，但和模型组相比却无统计学意义。这可能是通过兴奋垂体肾上腺轴或性腺轴的功能实现的，也可能与提高机体内E2受体敏感性或E2受体数目有关。降低成骨细胞和破骨细胞的活性，尤其是破骨细胞的活性，从而降低去卵巢大鼠骨的高转换状态。实验表明，骨松宁合剂结合运动使去卵巢大鼠血清中代表成骨细胞活性的BGP和代表破骨细胞活性的ACP、TRAP均显著性降低。这可能与骨松宁合剂结合运动抑制去卵巢大鼠体内IL-6与其他骨吸收因子的数目或增长有关。调节机体内微量元素的平衡，促进矿物质在骨中的沉积和胶原的形成，提高骨的强度和韧性。本实验的结构力学指标(股骨、腰椎的最大载荷及腰椎的最大挠度)和材料力学指标(股骨和腰椎的最大应力和弹性