REACH法规 第四卷译稿9.docx

1、REACH法规 第四卷译稿9B.6.皮肤敏感度测定1.测定方法1.1.引言注释：在与大众健康相关的毒性分类系统中，找寻潜在的人类皮肤感光剂的实验的灵敏度和能力是很重要的。没有一种方法能对所有的对人类皮肤有潜在致敏性的物质或者所有相关的物质都合适。选择实验方法时，要考虑各种因素，例如测定物的物理特性，包括其对皮肤的刺激性。两种使用天竺鼠的实验正在发展：一种是佐剂类型，在完全佐剂 (FCA)下，强行消除或延缓测定物对过敏症状的作用；另一种是非佐剂类型。佐剂类型实验比其它不使用完全佐剂的实验更能准确预计人类皮肤对物质作用作出的敏感反应。 天竺鼠极限化测试(GPMT)是辅助类型的实验。尽管还有其它一些

2、实验方法可以测定物质引起皮肤敏感反应的能力，GPMT仍是最可取的辅助类型的方法。关于物质化学特性的分类有多种，非佐剂类型（Buehler实验较佳）被认为灵敏度较差。 在某些情况下，更适宜采取进行局部注射的Buchler实验，而不是使用天竺鼠极限化皮肤注射的实验。当使用Buchler实验的时候，应给出科学理由。这个实验同时描述了GPMT方法和Buchler方法。只要可行和有科学的根据，也可使用其它方法。如果在一个公认的实验中观察到阳性现象，应指出测定物是潜在的感光剂，同时不必做进一步的天竺鼠实验。然而，如果在实验中观察到负反应现象，则要使用本实验所描述的方法进行天竺鼠实验。见描述部分B.1.2.

3、定义皮肤过敏：（过敏性皮肤炎）是皮肤对物质的免疫反应。对于人类来说，这种反应可分为瘙痒，红斑，水肿，丘疹，小囊或这些症状的综合。在其它物种中，反应现象可能不同，可能只有红斑和水肿。接触感应：让实验动物接触一段时间，使其对测定物产生过敏性反应。感应时间：接触感应后至少维持一星期，让过敏性症状形成。接触质疑：让先前涂了诱导处理过的测定物的动物接触一段时间，以确定此动物是否产生过敏性反应。1.3.标准物质每六个月，用已知的对皮肤有轻度到中度过敏刺激的物质测定实验技术的灵敏度和可信度。在准确进行的实验中，辅助类型的实验应有30，非辅助类型的实验应有15的轻度到中度过敏反应现象。建议使用以下物质。CAS

4、实验数据EINECS 实验数据EINECS 名称普通名称101-86-0202-983-3-己基肉桂醛-己基肉桂醛149-30-4205-736-82-巯基苯并噻唑(快热粉)kaptax94-09-7202-303-5苯唑卡因norcaine在有合适理由的情况下，可以使用其它符合以上标准的物质。1.4.测定方法原理测定物通过皮内注射和/或表皮注射注入实验动物。注射一定刺激量测定物后休息10到14天（诱导期），在这期间免疫反应渐形成。将经过接触刺激的动物与注射了刺激性测定物而在诱导阶段未经处理的对比动物样品的皮肤反应的范围和程度进行对比。1.5.测定方法描述如果测定物需要被清洗，应使用水或合适的

5、溶剂，避免改变已有的反应和损害表皮的完整性。1.5.1. 天竺鼠极限化测试(GPMT)1.5.1.1.预备健康的年轻成年白公天竺鼠应至少在实验前5天开始适应实验室条件。实验前将动物随机分成几组。根据实验使用方法，将动物样品的毛剪去，剃去或可能的话用化学方法除去。小心避免损伤皮肤。实验开始前和结束后将动物称重。1.5.1.2.实验条件1.5.1.2.1.实验动物通常使用实验室饲养的白公天竺鼠。1.5.1.2.2.数量和性别可用雄性和/或雌性动物。如果使用雌性动物，其应是未生育和非怀孕的。实验组至少有10只动物，对比组至少包括5只动物。当使用少于20只实验动物和10只对比动物和不能确定测定物是否一

6、种感光剂时，建议附加使用至少20只实验动物和10只对比动物实验。1.5.1.2.3.试剂浓度用于每个接触感应阶段的测定物的浓度应是能被组织忍受和引起轻度到中度皮肤发炎的最大量。用于接触刺激阶段的浓度应是不引起发炎反应的最大量。如果得不到其它信息，应用2到3只动物进行实验性测定以确定最佳浓度。若使用FCA处理的动物应仔细考虑测定物的浓度。1.5.1.3.步骤1.5.1.3.1.前言第0天，实验组在动物样品的两边肩膀皮内注射三种物质，每种0.1毫升，肩膀应脱净毛，以使每种注射的物质位于身体中线对称的两边。注射物1：FCA与水或生理盐水1：1（体积比）混合物。注射物2：合适的状态和浓度的测定物。注射

7、物3：合适浓度的测定物与FCA/水或生理盐水的1：1（体积比）混合物。对于注射物3，水溶性物质应溶于水然后再与FCA混合。脂溶性或非水溶性物质悬浮与FCA中与水相结合。测定物的最后浓度应与注射物2中使用的相等。注射物1和2注射在离头部最近处，彼此相邻，而注射物3注射在测定部分的尾部。第0天，对比组皮内注射三种物质，每种0.1毫升，注射在与实验组动物相同的部位。注射物1：FCA与水或生理盐水1：1（体积比）混合物。注射物2：未冲淡的媒介物注射物3：50的媒介物与FCA/水或生理盐水1：1的混合物。第57天，实验组和对比组如果测定物不是皮肤刺激性的，在局部诱导的约24小时前，剪去或剃去毛的测定部分

8、应用0.5毫升10%的用凡士林处理的硫酸钠，以使其产生局部发炎。第68天，实验组除去实验部分的毛。将覆盖了最佳形态的测定物滤纸（24厘米）贴于动物样品的实验部分，绑上绷带48小时。应选择合适的媒介物。固体应先碾碎制成合适的形态。可能的话，不要稀释液体。第68天，对比组除去实验部分的毛。用同样的方法将赋形剂贴于动物实验部分，绑上绷带48小时。1.5.1.3.2.刺激第2022天，实验组和对比组除去实验组和对比组动物侧腹上的毛。将测定物涂于动物样品的一边侧腹，另一边侧腹涂媒介物。用绷带固定24小时。观察和评级：实验组和对比组- 在移去补丁约21小时后,如有必要需清洁挑战部位并仔细剪或刮使脱毛。-

9、再过大概3小时后,也就是离开始测定其应用性48小时左右,可观察到皮肤反应,并根据附录中的程度等级做记录。- 离这次观察约24小时后,再进行一次72小时观察和记录。对测定组和对照组动物样品的盲读是被支持的.如果有必要阐明第一次测定的结果,那么在上次测定的约一星期后就要考虑又一次测定.下次测定也需用原来的对照组。所有来源于实验进程的皮肤反应以及任何异常现象,包括全身反应都要观察并根据Magnusson/Kligman（见附录）衡量等级记录下来。可以进行其它过程如历史病理检查,皮肤折层厚度测量等,以此来阐明一些可疑反应。1.5.2. Buehler测定1.5.2.1. 准备工作在测定前让健康年轻的成

10、年白化天竺鼠在实验室环境中至少适应5天。并且这些动物事先随机分配到治疗组。根据实验方法的不同,选择或剪或刮或用化学脱毛剂的手段来去除动物毛发,且要小心勿弄伤皮肤。测定的开始和结束分别称下动物体重。1.5.2.2. 测定情况1.5.2.2.1. 测定动物通常使用实验室品种的白化天竺鼠。1.5.2.2.2. 数量和性别雄性的或雌性的动物均可使用。如果使用雌性的动物必须是从未生育过的或未怀孕的。实验组中最少要20只动物,对照组中至少要10只。1.5.2.2.3. 剂量标准用于每个引导接触的测定物质的浓度时能产生温和但不过度刺激的最高量。而用于免疫性试验接触的浓度是不引起刺激的最高量。有必要的话可用2

11、、3个动物做个试点实验来得到合适的浓度。对于水溶性的测定物质，水或稀释的无刺激性的界面活性剂溶液可用作载体。对于其他测定物质，乙醇/水用于诱导阶段，丙酮用于免疫性试验阶段。1.5.2.3. 实验步骤1.5.2.3.1. 诱导阶段0天-实验组清除一侧毛发（仔细修剪）。实验补丁系统应准备好充足的已溶在合适载体中的测定物质（必须证明载体选择的正确性；如果合适的话，液态的测定物质无需稀释即可应用）。实验补丁系统应用于测定区域并且通过一个封闭的补丁或腔和一件合适的敷料与皮肤保持6小时联系。实验补丁系统必须是封闭的。一块可方可圆的棉衬垫正合适，但大小需约4-6平方厘米。使用一个合适的束缚物来约束能确保封闭

12、。如果使用包装可能会造成额外的接触。1天- 对照组清除一侧毛发仔细修剪载体应用类似于上述测定组实验补丁系统应用于测定区域并且通过一个封闭的补丁或腔和一件合适的敷料与皮肤保持6小时联系。如果能证明不需要一个阴性对照组，可使用阳性的对照组。6-8天和13-15天-实验组和对照组在第6-8天以及第13-15天在相同侧边的相同测定部位进行和0天一样的操作（如有需要清除毛发）。1.5.2.3.2. 免疫试验阶段27-29天-实验组和对照组清除实验组和对照组动物先前没经处理的一侧毛发（仔细修剪）。把一个含有适量测定物质的密封的补丁或腔应用于实验组和对照组动物原来没受处理的一侧，药物浓度是不引起刺激的最大量

13、。当相关时，一个含载体的封闭的补丁或腔也应用于实验组的对照组先前没受处理的一侧。通过一件合适的敷料保持6小时接触。1.5.2.3.3. 观察和评级- 在移去补丁约21小时后，清理测定部位的毛发。- 约3小时后（在应用实验补丁约30小时后），观察皮肤反应并根据附录中的等级标准做记录。- 在观察30小时后约24小时（在应用实验补丁约54小时后），再次观察皮肤反应并记录。对测定组和对照组动物样品的盲读是被支持的.如果有必要阐明第一次测定的结果,那么在上次测定约一星期后就要考虑再一次测定.下次测定也需用原来的对照组。所有来源于实验进程的皮肤反应以及任何异常现象,包括全身反应都要观察并根据Magnuss

14、on/Kligman（见附录）衡量等级记录下来。可以进行其它过程如历史病理检查,皮肤折层厚度测量等,以此来阐明一些可疑反应。 2.实验数据（GPMT和BUEHLER测定）实验数据需归纳成表格形式，要表示出每次观察中每个动物样品的皮肤反应。3.实验结果报告如果在天竺鼠测定前已进行过一次测定分析，那么关于测定的描述或参考文献（如局部淋巴结测定（LLNA），鼠耳肿胀实验（MEST），包括过程细节需连同从测定或参考物质中获得的结果一并给出。实验结果报告（GMPT和BUEHLER测定）如果可能的话，实验结果报告要包含以下信息：测定动物：- 使用的天葵鼠的品种；- 动物样品的数目、年龄以及性别 ；- 来源

15、、房间环境、食物等；- 测定开始时每个动物样品的体重。实验状况：- 补丁固定技术；- 使用的补丁材料及缝补技术的细节；- 附带关于将用于实验中诱导阶段和免疫试验阶段的浓度结论的试点研究的结果；- 测定物质的准备、应用及清理细节；- 对于载体选择的证明；- 用于诱导接触及免疫试验接触阶段的载体和测定物质的浓度以及用于与诱导阶段和免疫试验阶段的物质总量。实验结果：- 是对最近的敏感性和可靠性的核查结果的总结（见1.3）,包括了关于使用的物质、浓度和媒介的信息；- 各个等级系统内的每个动物；- 是对观察到的自然现象和程度现象的叙述性描述；- 任何历史病理学的结果。结果讨论。结论。4.参考文献这种方法类似于OECD TG406。表格：对于挑战补丁测定反应评估的Magnusson/Kligman等级标准0=无可见的变化1=个别的或杂凑的红斑2=中等程度的或融合性的红斑3=严重程度的红斑及肿胀