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1、科学仪器学 离心机备考复习第六章 离心分离技术 离心技术(centrifugal technique)是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。6.1 基本原理6.1.1 离心力(centrifugal force，Fc) 离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力(Fc)的大小等于离心加速度2X与颗粒质量m的乘积，即： Fcm2X 其中是旋转角速度，以弧度秒为单

2、位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位：m是质量，以克为单位。6.1.2 相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力随之变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 RCF = F离心力/F重力 = m2X/mg = 2X/g =（2n/60）2X/980=Xn21.11810-5 式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度(980cmsec2)；n为

3、转子每分钟的转数(rpm)。 在上式的基础上，Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图，见图32。在用图32将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。图32 离心力的转换列线图例如，已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。6.1.3 沉降系数(sedimentation coefficient，s) 根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗

4、粒在单位离心力场中粒子移动的速度。S = （1/2X）（dx/dt） =（1/2dt）（dx/X）积分得：S = 2.303（logX2-logX1）/2（t2-t1）若用2n/60表示，则 S = 2.1102log（X2/X1）/n2（t2-t1） 式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离；X2为离心后粒子离旋转轴的距离。S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。6.1.4 沉降速度(sedimentation velocity) 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。 dx/dt = 2r2（p-m）/92X =

5、 d2（p-m）/18 2X 式中r为球形粒子半径，d为球形粒子直径；为流体介质的粘度；p为粒子的密度；m为介质的密度。 从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表示式也可表示为： S = （1/2X）（dx/dt）= d2（p-m）/18从该式中可看出，（1）当p m ，则SO，粒子顺着离心方向沉降。（2）当p =m ，则S= 0，粒子到达某一位置后达到平衡。（3）当p m ，则Sm。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一

6、系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。由于p m可知S0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部，离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。6.5.3 等密度离心法等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中

7、所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，即p m时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即p =m时，dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 一般在物质的大小相近，而密度差异较大时应用此法。常用的梯度液是CsCl。6.6 梯度溶液的制备 1. 梯度材料的选择原则 作为一种理想的梯度材料应具备以

8、下几点：（1）与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。（2）可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。（3）不会对离心设备发生腐蚀作用。（4）容易纯化，价格便宜或容易回收。（5）浓度便于测定，如具有折光率。（6）对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：（1）糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原。（2）无机盐类：CsCl、RbCl、NaCl、KBr等。（3）有机碘化物：三碘苯甲酰

9、、葡萄糖胺等。（4）硅溶胶：如Percoll。（5）蛋白质：如牛血清白蛋白。（6）重水。（7）非水溶性有机物：如氟代碳等。2. 梯度材料的应用范围(1)蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 (2)聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 (3)氯化铯：是一

10、种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 (4)卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 (5)Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP)，渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。3密度梯度超速离心方法

11、将二个不同浓度的梯度液分装于梯度混合器中，右侧为高浓度梯度液，左侧为低浓度梯度液，打开二室间的控制阀，右室在磁力搅拌器搅动下，打开梯度加液阀，缓缓的将梯度液沿管壁加入离心管中，此时由于右室液平面下降，而左室的液体不断的补充，使离心管中的液体从高浓度向低浓度产生线性梯度。密度梯度离心管制备后，将需分离的样品小心的加在离心管的上方，然后装到水平式转头上开始离心，离心过程中，样品中的成份根据其密度不同而在相应的梯度液中沉降下来，产生清晰的分离条带，离心完成后取出离心管，可用以下几种方法收集不同区带的样品组份：(1) 用注射器和滴管由离心管上部吸出。(2) 有针刺穿离心管底部滴出。(3) 用针刺穿离心

12、管区带部份的管壁，把样品区带抽出。(4) 用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集，见图37。6.7 离心操作的注意事项：高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。1. 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，

13、以便使负载均匀地分布在转头的周围。2. 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。3. 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。4. 离心过程中

14、不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。5.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 图37 密度梯度超速离心方法实验二十二 序列超速离心分离血浆脂蛋白【目的与要求】了解超速离心分离技术的原理，掌握制备性分离血浆脂蛋白的方法。【原理】基本原理见第六章6.1、6.2节。本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过序列超速离心大量制备各种血浆脂蛋白，经透析脱盐、PEG200

15、00浓缩后保存备用。【操作步骤】1 血浆制备：取献血员全血400mL，EDTANa2抗凝，2000rpm离心15min，分离血浆。根据血浆体积，加入0.015%的苯甲基氟磺酰（PMSF），防止脂蛋白变性。 2CM和VLDL分离：血浆中加入适量的NaBr，调节密度至1.019g/ml，分置于离心管（38.5ml/管）中，加盖，用1.019g/ml密度液平衡，放入RP 50T转头，在10下40，000rpm（145，000g）离心20小时。CM和VLDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。3 LDL分离：下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.060g/ml，分置于离心管中，加盖，用1.060g/

16、ml密度液平衡，放入RP 50T转头，在10下40，000rpm（145，000g）离心20小时。LDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。4 Lp（a）和HDL分离：下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.125g/ml，分置于离心管中，加盖，用1.125g/ml密度液平衡，放入RP 50T转头，在10下45，000rpm（185,000g）离心24小时。Lp（a）、HDL和少量LDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。5 HDL分离：下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.21g/ml，分置于离心管中，加盖，用1.21g/ml密度液平衡，放入RP 50T转头，在10下45，000rpm（1

17、85，000g）离心24小时。HDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。下层含有总量的50%的游离apoA-，可用于分离apoA-。6 透析：已分离好的各部分脂蛋白含有大量的NaBr，需要透析脱盐。将各种脂蛋白溶液分别装入透析袋中，对抗0.01mol/L PBS（pH7.4）溶液透析，每6小时更换1次透析液，共3次，第3次可透析过夜。7 浓缩：透析过夜的脂蛋白溶液连同透析袋一起放入盛有40%的PEG20000的烧杯中，浓缩至适当体积。注：也可以透析和浓缩一步进行，即将分离后的脂蛋白溶液装入一端接有梨形瓶的透析袋中(此透析袋能抵抗1个以上大气压)，透析袋浸入2000ml装有0.01mol/L PBS

18、（pH7.4）透析液的量筒中，梨形瓶的另一端通入氮气，施加1个大气压(760mmHg)的氮气后将梨形瓶的一端扎死，为了使透析效率增加，透析过程使用磁力搅拌，并不断更换透析液。当样品被浓缩至一定浓度(或体积)后停止透析，取出样品。【试剂】1 NaBr2 密度液：以NaBr与双蒸水配制，以比重计测定密度。配制成1）1.019g/ml； 2）1.060g/ml；3）1.125g/ml；4）1.21g/ml 四种密度液。3 苯甲基氟磺酰（PMSF）4 0.01mol/L PBS（pH7.4） 5 40% PEG20000【材料】1 比重计： 1.000-1.100g/ml和1.100-1.200g/m

19、l比重计2 离心管：聚碳酸酯厚壁离心管，Hitach 3 角度转头： RP50T Hitach 4 超速离心机：Hitach CP80MX5. 平衡天平实验二十三 密度梯度超速离心法分离血浆脂蛋白【目的与要求】了解超速离心分离技术的原理，掌握分析性分离血浆脂蛋白的方法。【原理】基本原理见第六章6.1、6.2节。本实验以KBr为密度介质制备不连续密度梯度溶液，利用各血浆脂蛋白颗粒密度不同，经过一次超速离心分离各血浆脂蛋白，经透析脱盐、PEG20000浓缩后保存备用。【操作步骤】1 按0.325g KBr/ml血浆的加样量加入固体KBr，溶解，以调节血浆密度至1.21g/ml。2 吸取4.0ml血

20、浆加入13.5ml容积的超速离心管底部。不足4.0ml的血浆样品以密度液A补足至4.0ml。3 取3.0ml密度液B，用吸管移液法沿离心管内壁（倾斜45）缓慢加入超速离心管，小心注意：勿使两液面相混。4 取3.0ml 密度液C，同法加入超速离心管。5 取2.5-3.0ml密度液D，同法加入超速离心管。上盖，放入SW41转头。6 10，41000rpm（286，000g）离心24小时。7 离心后，CM和VLDL位于离心管顶部；LDL位于其下1.019g/ml与1.063g/ml两层的结合部；HDL位于1.063g/ml与1.21g/ml两层的结合部。8 用虹吸法或切割法小心取出各血浆脂蛋白，分别装入透析袋中，对抗0.01mol/L PBS（pH7.4）溶液透析过夜。9 将透析过夜的脂蛋白溶液连同透析