脲酶抑制剂综述.docx

1、脲酶抑制剂综述脲酶抑制剂综述抑制剂研究进展1、脲酶抑制剂研究进展1.1脲酶抑制剂种类及作用原理脲酶是氨基水解酶的一类酶的通称，是一种作用于线型酰胺C-N键（非肽）的水解酶。土壤脲酶抑制剂是对土壤脲酶活性有抑制作用的化合物或元素。Conrad早在1940年就指出向土壤中加入某些物质可以抑制脲酶活性并延缓尿素水解。在随后的几十年里，脲酶抑制剂的研究取得很大进展，包括对尿素水解、NH3挥发、尿素N土壤转化、尿素利用率、作物产量的影响等。脲酶抑制剂主要有无机物和有机物二大类。无机物中主要是分子量大于50的重金属化合物如Cu、Ag、Pb、Hg、Co、Ni、Au、As、Cr等元素的不同价态离子；有机化合物

2、中包括对氨基苯磺酰胺、二硫代氨基甲酸盐、羟基草氨酸盐、有机汞化合物、酚类、醌及取代醌类、磷胺类化合及其转化物等。Bremner和Douglas证明二元酚和醌是当时最有效的有机化合物，银和汞盐是最有效的无机化合物62。Mulvaney和Bremner（1981）、Byrnes和Freney 等(1995)指出，最有效的脲酶抑制剂是醌如-苯醌和氢醌（HQ）、二元酚和磷胺类化合物如N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）、苯基磷酰二胺（PPD）、环己基磷酰三胺（CHPT）等65。其中HQ被认是较有效并经济的，而NBPT、PPD、CHPT等磷胺化合物的抑制效果则是最好的。对脲酶抑制剂的筛选，通常注意的只是该化

3、合物使用后尿素在一定培养时间内的残留量，而对脲酶抑制剂的作用机制研究的较少。重金属离子和醌类物质的脲酶抑制作用机理相同，它们均能作用于脲酶蛋白上对酶促有重要的作用的巯基（-SH），抑制作用的效果与金属-锍化物和醌-锍化物复合体的解离能力呈反比。磷胺类化合物的作用机理为该类化合物与尿素分子有相似的结构，可与尿素竞争与脲酶的结合位点，而且其与脲酶的亲和力极高，此种结合使得脲酶减少了作用尿素的机会，达到了抑制尿素水解的目的。综合国内外的资料研究，脲酶抑制剂的作用机理主要表现在以下几个方面:(1)脲酶抑制剂占据了脲酶水解尿素的活性位置，降低脲酶活性。(2)脲酶抑制剂可以改变土壤环境中的氧化还原条件，降

4、低脲酶活性。(3)脲酶抑制剂中有些疏水性物质，可以使尿素的水溶性降低，减慢尿素水解速率。(4)脲酶抑制剂中有些抗代谢类物质，可以打乱能产生脲酶的微生物代谢途径，阻碍脲酶的合成，降低尿素的分解速度。(5)脲酶抑制剂本身与尿素物理性质相似，在土壤中可以保护尿素分子不被脲酶水解，但是脲酶抑制剂也不能完全抑制土壤中所有的脲酶，应保持脲酶具有一定的活性。否则，会影响到土壤对植物的供氮。 脲酶抑制剂需要在一定的环境条件下应用。土壤pH、通气条件、水分状况以及尿素的浓度等都是影响脲酶抑制剂活性的因素。不同的脲酶抑制剂所适应的环境条件也不同。比如脲酶抑制剂N-丁基硫代磷酰二胺(nBPT)受土壤pH的影响较小，

5、表明nBPT既适用于酸性土壤，也适用于碱性土壤。苯基磷酰一胺(PPD)作为脲酶抑制剂虽然有潜力，但是易于分解。脲酶抑制剂氢醒(HQ)在通气性良好的土壤中施用时，效果不如nBPT和PPD；在嫌气土壤中施用时，效果又不及PPD;有研究表明，HQ用量的增加会减弱土壤脲酶活性。所以，不同的脲酶抑制剂在不同的土壤环境中抑制效果不同，同一种抑制剂在不同的土壤条件下抑制效果也有所不同。脲酶抑制剂在脲酶活性高的土壤中施用能够发挥更好的抑制作用。 尿素经脲酶水解为铵态氮后才能被作物吸收利用，但是基于目前的环境问题以及氮残留在土壤中可能会造成的环境问题，延缓脲酶的水解作用非常重要，所以许多学者都己经在脲酶抑制剂上

6、做了大量研究。到目前为止，人们研究了脲酶抑制剂对土壤环境、植物生物量、产量等的影响。研究较多的脲酶抑制剂有N-丁基硫代磷酰二胺(nBPT)和氢醌(HQ)等。周礼恺等人在1992年就研究了HQ在尿素的水解、气态氮的释放、铵态氮的硝化、硝态氮反硝化作用以及微生物固持等过程中所起的作用。结果表明，HQ不仅可以延缓尿素的水解，减少NH3挥发损失，更重要的是，它还可以影响尿素水解产物的进一步反应过程，使得尿素氮对作物有持续性供应，减少了氮的损失。王小彬等的研究发现，尿素表施和种旁施用，nBPT的用量完全不同。表施时，nBPT用量为0.25%最佳；种旁施用时，nBPT用量为0.15%时能够更好的促进作物氮

7、的吸收。脲酶抑制剂nBPT对土壤中各种细菌和酶的作用也有一定的影响，0.1-0.5%的nBPT对土壤脲酶活性影响较小;浓度在1%时抑制效果最为显著。低浓度(0.1mg/mL)的nBPT对放线菌、细菌的生长有一定的促进作用，但中高浓度的nBPT却抑制了它们的生长。nBPT可以抑制细菌和放线菌的发酵产酶，最大抑制率分别可以达到67.1%和55.4%。王玉琪等研究了不同用量的脲酶抑制剂氢醌对小白菜光合特性和氮代谢的影响。结果表明：适量的氢醌能增大小白菜叶片的气孔导度，降低细胞间CO2浓度，降低蒸腾速率，提高净光合速率;使小白菜叶片谷酰胺合成酶活性、硝酸还原酶活性、蛋白质含量、总氮含量、谷氨酸脱氢酶活

8、性提高，降低游离氨基酸含量。氢醒(HQ)在土壤中的作用 HQ是一种白色针状结晶型物质，易燃，熔点172-175，沸点285-287，相对密度1.328kg/m3)，易溶于热水、乙醇及乙醚，微溶于苯。早在20世纪80年代，中国科学院沈阳应用生态研究所就对HQ抑制脲酶的作用进行了大量的研究，发现HQ作为脲酶抑制剂具有抑制率高，成本低，来源广泛的特点。在普通尿素中添加HQ可使氮肥利用率由40%提高到52%以上。总的来说，HQ在土壤中的作用主要表现在以下儿个方面:对脲酶活性的抑制。这是HQ最主要的作用。HQ对土壤脲酶活性的抑制率及其抑制时间随着其施用量的增加而提高，与土壤脲酶活性呈显著负相关关系，并随

9、着时间的推移而逐渐降低。但是由于土壤质地不同，HQ的作用效果也会因土壤脲酶活性大小的不同而呈现出不同。对土壤尿素氨挥发的抑制。因为HQ对土壤脲酶活性有抑制作用，所以延缓了脲酶对尿素的水解，也就抑制了因尿素水解而导致的氨挥发，减少了氮的挥发损失，降低了对大气环境的污染。周礼凯等人用硼酸吸收法对添加了HQ的灭菌和不灭菌土壤的氨挥发量进行测定，结果表明了灭菌土壤氨挥发量和HQ的用量有很好的负相关关系，但是在不灭菌土壤中，由于土壤微生物的作用，氨挥发的机理比较复杂。汤树德等的研究也表明HQ对土壤氨挥发的影响，不仅取决于HQ对土壤脲酶活性的抑制强弱和抑制时间，在很大程度上也取决于土壤质地及其对氨的吸收饱

10、和度。对土壤硝化和反硝化作用的抑制。尿素氮损失的一个重要途径就是因硝化作用导致的硝酸盐的淋失，反硝化作用所导致的含氮气体的挥发。HQ对土壤尿素的硝化作用有很好的抑制效果，减少了硝酸盐的淋溶损失。同时，HQ对反硝化细菌也有很好的抑制作用，降低了生物反硝化的速率，从而减少了反硝化作用产生的含氮气体的挥发损失。增加了土壤的生物固持。HQ在对尿素氮的生物固持方面也起到了很好的作用，有研究表明施用HQ后土壤生物固持氮量增多，这就意味着土壤中的氮素对作物的持续供应能力有所保持甚至增强。1.2脲酶抑制剂在作物上的应用效果使用脲酶抑制剂抑制尿素水解、减少NH3挥发损失的主要目的是提高作物尿素N利用率、保持土壤

11、N素肥力、减少N损失及由此产生的环境污染和增加作物产量。Rao和Ghai（1986）在盆栽试验中发现，使用脲酶抑制剂HQ和PPD在小麦收获时N吸收分别增加7.4%和13.8%，产量分别增加20%和25.1%；HQ在增产的同时使生物量增加11.1%，但PPD没有使总生物量增加；HQ对表观N回收率的影响极小，PPD使其增加9.5%。Cai等（1989）证明1%的PPD和NBPT分别使N利用率增加4.8%和6.9%，产量分别增加6.8%和0%，即在盆栽条件下PPD和NBPT对N利用率和作物产量并没有显著影响。Joo等(1991)证实施用尿素N量0.25%的NBPT使土壤-植物（肯塔基蓝草）系统N回收

12、率增加16.2%，但使用0.5%的NBPT，该系统的N回收率与对照相比并没有发生变化，其原因可能是0.5%的NBPT虽延缓了尿素水解，但由于5-6月较高的降雨量（130mm）使根域下残留尿素随水流失。 Li等（1993）利用同位素示踪试验证明PPD和NBPT分别将尿素N利用率提高4.76%和8.82%，但产量与对照相比均没有提高，而HQ则无论是N利用率和产量均低于对照。Wang等 (1995)对小麦田施用脲酶抑制剂NBPT的效果研究表明，0.15%与0.25%尿素量的NBPT增加了作物的N吸收，但产量与不施抑制剂没有差别。但Waston等(1990)证明在施用尿素时，NBPT的使用增加了黑麦草

13、的产量。Freney等(1995)对水田水稻种植条件下施用脲酶抑制剂及杀藻剂的试验证明，与单施尿素相比，脲酶抑制剂CHPT的使用显著提高了尿素N回收率，但NBPTO的效果与尿素相比没有显著差异。与脲酶抑制剂单独使用相比，杀藻剂与脲酶抑制剂配合使用均使N回收率降低（尽管降低未达到显著水平），但可使水稻产量显著提高，而单独使用脲酶抑制剂NBPTO、CHPT的水稻产量与尿素相比差异并不显著。2硝化抑制剂种类及其研究进展2.1 硝化抑制剂的种类国际上对硝化抑制剂的研究探索起步较早，迄今为止，已发现有数百种化合物显示了或强或弱的硝化抑制效应。从来源上讲，硝化抑制剂可以分为自然提取物和人工合成的化合物两大

14、类。自然提取物在被发现具有硝化抑制作用之前一般是被作为有机肥施用的。如印度楝树，其有效成分可用丙酮、酒精等有机溶剂提取，与肥料特别是尿素混合施用具有一定的硝化抑制效果。每公顷施用2040kg的楝树饼在28下培养，其硝化抑制时间可达160天，且可提高水稻产量。Slanger和 Kerkhoff（1984）从Pongamia glabra的树皮或种子中用酒精可以提取到一组具有硝化抑制活性的呋喃类黄酮类化合物，其硝化抑制能力在培养前五周可与N-Serve媲美。有些植物或植物残体在生长或死亡腐解过程中也可以分泌一些具有硝化抑制特性的化合物，如酚类、萜类、有机酸等。Bending和Lincoln（200

15、0）发现十字花科植物在生物降解过程中会产生很多具有硝化抑制特性的低分子量挥发性含硫化合物，其中异硫氰酸盐可显著降低土壤中氨氧化菌的数量并抑制其生长。但这些非专一性的抑制剂在土壤中保持活性的时间较短，且其硝化抑制效力一般较低。Bremner 和McCarty（1991）的研究表明，植物根系分泌的酚类物质,其浓度达到10-4M时，才表现出抑制作用，且其抑制率都在15%以下，远低于商业硝化抑制。因此，目前已开发的硝化抑制剂品种仍以人工合成的化合物为主。从化学形态上讲，人工合成的硝化抑制剂主要分为无机和有机化合物两大类。无机化合物以重金属盐类为主，但由于重金属的施用易造成环境的二次污染，因此，其作为硝

16、化抑制剂的开发和应用价值受到了一定限制。有机硝化抑制剂主要分为以下四大类：第一类为含硫化合物。这是众所周知的一类硝化抑制剂。含硫的氨基酸如蛋氨酸和甲硫氨酸均可抑制土壤硝化作用的进行，但二者对硝化作用的抑制是由于其生物降解形成的挥发性含硫化合物如CS2在发挥作用。其他的含硫化合物如二甲硫（又称甲硫醚）、二甲基二硫醚、二硫化碳、烷基硫醇、乙硫醇、硫代乙酰胺、硫代硫酸、硫代氨基甲酸盐等对土壤硝化作用均具有一定的抑制效应。其中二甲硫、二甲基二硫醚的硝化抑制效果较弱；二硫化碳施入土壤后可迅速扩散，对氨氧化的抑制效应较强，但其化学性质不稳定，易挥发，易燃，在土壤中存留时间短；乙硫醇与Nitrosomona

17、s europaea 之间的作用比较复杂，既可以抑制氨的氧化，也可以抑制羟胺的氧化，但对氨氧化的抑制效应更强。此外，硫脲、烯丙基硫脲、烯丙基硫醚等对土壤硝化作用也均具有显著的抑制效应，但烯丙基硫脲是一种基于结构的可逆的非竞争性抑制剂，而烯丙基硫醚是一种专性的、基于结构的不可逆的AMO的灭活剂，它们对不同供试土壤中硝化菌的抑制程度不同，可能与不同土壤中有机质含量不同，以及不同系统中的硝化菌群落对该抑制剂的敏感程度不同有关。 第二类为乙炔及乙炔基取代物。乙炔是Hynes and Knowles（1978）年在Nitrosomonas europaea的纯培养试验中被首次发现对自养硝化作用具有抑制效

18、应的，在压力低至0.1Pa时即可以发挥作用，压力为10Pa时即可完全抑制纯培养条件下N. europaea参与的硝化作用，对催化硝化作用的氨单加氧酶（AMO）具有自我钝化作用，是一种专性的非竞争性抑制剂。很多乙炔基取代物如2-乙炔基吡啶、苯基乙炔等也都是具有潜在硝化抑制作用的化合物，其中2-乙炔基吡啶的抑制效果在被供试的21种非气态乙炔衍生物、14中吡啶类化合物中是最好的（McCarty and Bremner, 1989a）。然而被羧基取代的乙炔却没有这种功能，可能与羧基本身带负电荷，与AMO活性位点的亲和力较低有关（McCarty and Bremner, 1989a）。乙炔的有效性受土壤

19、条件影响很大，在粘粒和有机质含量较高的土壤中，乙炔的施用效果较差。当土壤水分含量较高时，也会影响乙炔在土体中的扩散，从而影响其硝化抑制效果（Abbasi and Adams, 2000）。第三类为氰胺类化合物。此类化合物中最有代表性的就是双氰胺。双氰胺（DCD）是1918年被首次报道具有硝化抑制特性的化合物，七、八十年代美国开始把它作为一种商品在农业上推广应用。前西德SKW 公司利用双氰胺的硝化抑制特性注册了商品名为Didin的硝化抑制剂产品（Rajbanshi et al., 1992）。DCD是一种白色结晶型粉末，不可燃。熔点207209C，相对密度1.400（25/4C），易溶于水（13

20、C水中的溶解度为22.6g L-1）和液氨（Jacinthe and Pichtel, 1992）。DCD的硝化抑制效果显著，在T 4时很稳定，所以可与任何一种肥料结合施用，但不宜与酸性肥料共存较长时间。其蒸汽压为0.237 N m-2，在温度35C或更低的情况下很容易包膜到肥料表面。一般AM的有效施用量为56kg ha-1，抑制时间一般为20天至1个月。AM在土壤中的残留量受土壤阳离子交换量和土壤颗粒比表面积的影响很大（Slangen and Kerkhoff, 1984）。5-乙氧基-3-三氯甲基-1,2,4-噻重氮（Terrazole氯唑灵），是由美国巴尔的摩的Olin 公司开发的，以T

21、errazole注册的土壤杀真菌剂；作为硝化抑制剂的注册商标为“Dwell”。室温下的蒸汽压为0.0133 N m-2，对土豆、甜菜、莴苣、洋葱等其施用量为0.6-1.1kg ha-1。其硝化抑制时间的长短受施用量、土壤特性等影响显著（Slangen and Kerkhoff, 1984）。3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP） DMPP是近几年被德国BASF公司(BASF AG Ludwigshafen, Germany)开发的一种新型硝化抑制剂，含有该抑制剂的肥料其注册商标为ENTEC（简称“ASN”：由NH4NO3和（NH4）2SO4按21比例混合而成，含18.5%的NH4+-N和7.5%

22、的NO3-N，14%的S和0.29%的DMPP）（Azam et al., 2001; Zerulla et al., 2001）。研究表明，其施用量为0.51.5 kg ha-1时就可以使田间条件下的硝化抑制时间持续410周，当在土壤中均匀分布时，0.39 g DMPP g-1土壤就可以起到显著的硝化抑制效果（Azam et al., 2001; Zerulla et al., 2001）。与DCD相比，DMPP在土壤中的降解速度慢，在一个作物生长季结束时，DCD即会完全矿化，而DMPP的残留量仍可达最初施用量的16%（Weiske et al., 2001a）。由于土壤胶体和有机质的吸附作

23、用，在土壤中的移动性也非常有限，不易发生与NH4+在土壤剖面中的分离现象以及淋溶损失的问题（Azam et al., 2001; Fettweis et al., 2001）。DMPP的生物毒性很低，当其施用量为推荐量的8倍时，也不会对作物造成任何毒害，且在农产品中的残留量低（Fettweis et al., 2001; Zerulla et al., 2001）。但Irigoyen等（2003）的研究表明，在10C和20C条件下，与DCD相比， DMPP的硝化抑制强度及有效抑制时间等均没有表现出任何优势；且与其他硝化抑制剂一样，其抑制效果和有效抑制时间受很多因素的影响。Barth等（2001

24、）采用多元回归分析的方法表明，土壤质地、pH、土壤微生物学参数如过氧化氢酶活性等这些影响DMPP吸附的因素，以及土壤潜在的硝化能力是影响DMPP硝化抑制效果发挥的重要因子。2.2 硝化抑制剂的作用机理不同的硝化抑制剂其作用机理是不同的（Prasad and Power, 1995）。概括来讲，一般的硝化抑制剂是通过释放毒性化合物，直接影响硝化菌群落及硝化活性来抑制土壤中的硝化作用（Bending and Lincoln, 2000）, 但Nitrosomonas sp. 的不同菌株对不同或同一抑制剂反应的敏感程度不同（Neufeld and Knowle, 1999）。其抑制途径主要有以下几种

25、：(1) 通过直接影响亚硝化细菌的呼吸作用（电子传递链）以及细胞色素氧化酶的活性，使亚硝酸细菌无法进行呼吸，从而抑制亚硝化细菌的生长繁殖；（2）改变土壤微环境，降低土壤pH，从而抑制亚硝化细菌的生长繁殖。（3）通过鏊合铵氧化酶活性位点的金属离子来抑制硝化反应。另有文献报道，有小部分化合物则是通过影响土壤氮的矿化和固持过程而对土壤硝化过程表现出抑制作用的，原因是当土壤微生物区系利用该化合物作为C源时引起矿质氮的固持，或者说通过影响土壤有机质的矿化固持作用来实现其硝化抑制效果，如单萜等萜（烯）类化合物，这是对AMO的一种非竞争性抑制（White, 1991; Bremner and McCarty

26、, 1991; Bending and Lincoln, 2000）。众所周知，铵（氨）的氧化反应是由包括氨单加氧酶在内的附着在膜上的一系列蛋白质催化的反应（Bdard and Knowles, 1989）。氨单加氧酶（AMO）是一种胞内酶，至今没有被分离提纯，目前从分子生物学水平上对硝化抑制剂作用机理的研究还仅限于国外报道。AMO是活性位点上含有Cu的金属酶（Shears and Wood, 1985; Ensign et al., 1993）。能够与铜结合的化合物和螯合剂如硫脲 (TU)、烯丙基硫醚等都可以抑制其活性（Bdard and Knowles, 1989; Iizumi et a

27、l., 1998; Stein and Arp, 1998a）。此外，AMO具有较为广泛的底物专性，除了可以氧化氨中的N-H键外，还可以氧化芳基中的C-H键，烷基（烃基）中的C-H键（Hyman et al., 1988）和C=C键（Rasche et al, 1990），断裂的C-O-C键，催化氧化乙硫醇为亚砜（Juliette et al., 1993b），可以甲烷、硫、脂肪族、芳香族、卤代化合物、苯酚（将苯酚氧化为对苯二醌）、nitrapyrin等40多种化合物为底物，与氨竞争氨单加氧酶（AMO）的活性位点，同时还可以和氨竞争还原剂，从而抑制土壤硝化作用的进行（Vannelli and Hooper, 1992; McCarty, 1999）。影响AMO活性的硝化抑制剂，其行为机理又可概括为以下几个方面：一是作为一种可逆的抑制剂，如二硫化碳，它不是AMO