益生菌对刺.docx

1、益生菌对刺益生菌对刺参生长、消化和非特异性免疫相关酶活性的影响摘 要研究了一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus, BC-02)不同使用方式(活菌、灭活菌和芽孢）对刺参(Apostichopus japonicus)生长、消化和非特异性免疫相关酶活性的影响。芽孢杆菌BC-02的添加量分别为107、109和1011cfukg-1 (以活菌量计)，以投喂基础饲料组作为对照，实验时间为58d。结果表明：添加109和1011cfukg-1活菌和芽孢对刺参生长具有显著的促进作用(P0.05）。在109和1011cfukg-1添加量下，活菌和芽孢处理刺参肠道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性显著高于对照

2、(P0.05)，而灭活菌仅在109cfukg-1添加量下脂肪酶活性显著高于对照(P0.05)。不论活菌还是芽孢状态下，三种添加浓度均能有效提高刺参体腔液中刺参免疫酶活性。而在灭活菌状态下，109和1011cfukg-1的处理组SOD活性显著高于对照(P0.05)，107、109和1011cfukg-1的处理组ACP活性均显著高于对照(P0.05)，1011cfukg-1的处理组AKP活性高于对照(P0.05)，109和1011cfukg-1的处理组LSZ活性显著高于对照(P0.05)。综合比较表明，芽孢杆菌BC-02对刺参的适宜使用方式为活菌和芽孢，适宜浓度为(109-1011)cfukg-1

3、，可以有效提高刺参的生长、消化酶活性和非特异免疫力。关键字：蜡样芽孢杆菌；生长；消化酶；非特异性免疫酶；刺参 Effects of different states of Bacillus cereus on Growth Digestive Enzyme Activities and Non-Specific Immune Enzyme Activities in Apostichopus japonicusAbstractEffects of different states of Bacillus cereus (BC-02) on growth digestive enzyme act

4、ivity and the capacity of non-specific immunity in Apostichopus japonicus were studied over 58 days. The states of the BC-02 were Active, Inactive and Spore Powder. The additive does of living bacillus cell in feed were 0, 107, 109, 1011cfukg-1, respectively. Results shows that: The growth of A. jap

5、onicus enhanced significantly (P0.05) when BC-02 added in the states of Active and Spore Powder with the does of 107 and 109cfukg-1, while there was no effect on growth with the inactive state of BC-02. The activity of digestive enzymes of A. japonicus : The activities of Protease、AMS and LPS were i

6、mproved when BC-02 added in the states of Active and Spore Powder with the does of 109 and 1011cfukg-1 (P0.05). When added the BC-02 with the state of inactive, only LPS activity was significantly improved(P0.05). The capacity of non-specific immunity in A. japonicus: Added Active or Spore power wit

7、h an appropriate amount of BC-02 can effectively improve the capacity of non-specific immunity in A. japonicus. When BC-02 added in the state of Inactive, the activities of SOD and LSZ were improved (P0.05) only with the additive does of 109cfukg-1 and 1011cfukg-1. The dose of three concentrations a

8、ll of the Inactive BC-02 can improved (P0.05) the activities of ACP in A. japonicus. Only with the additive does of 1011cfukg-1 of the Inactive BC-02 can improve the AKP activity (P0.05). According to the results, it could be concluded that the optimal additive states of BC-02 were Active and Inacti

9、ve, and the appropriate concentration of BC-02 is (109-1011)cfukg-1, the growth rate, activities of digestive enzyme and the capacity of non-specific immunity in A. japonicus could be significantly improved.Key Words: Bacillus cereus; growth; digestive enzyme; non-specific immune enzyme; Apostichopu

10、s japonicus1 前言刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothroidea) ，体壁内含有丰富的胶原蛋白，黏多糖等多种生物活性物质，具有很高的药用和营养价值，自古以来就深受我国人民喜爱1-2。目前刺参已成为我国北方最大的海水养殖经济种，在我国辽宁、山东、河北等沿海省份均有大规模养殖3-4。据统计，我国2011年海参养殖产量总计达13.8万吨，同比上年增长5.72%，其中山东省海参养殖量为12.1万吨；2011年全国海参增养殖面积总计达15万公顷，山东省刺参增养殖面积达到 5.1万公顷4。但随着近年来海水养殖

11、业的高度集约化程度，又缺乏科学合理的管理，腐皮综合征等暴发性病害频发，导致了刺参幼苗的大量死亡，严重制约了刺参养殖业的可持续发展5-7。传统的水产病害以化学防治和使用抗生素为主，但抗生素的过度使用不仅使细菌产生了抗药性，还干扰和破坏养殖环境的正常的微生物区系，致使养殖环境中微生物生态失调8。另一方面，过多地摄入有抗生素残留的养殖动物会导致慢性中毒，危及人体健康9。近年来，人们开始尝试在养殖水体中使用益生菌来抑制病原微生物的生长从而改善水体生态环境，或将益生菌作为饲料添加剂投喂以此来改善养殖动物胃肠道菌群环境，增强水生动物的免疫力和抗疾病感染能力10-12。最初益生菌的研究主要集中在鱼类幼体,目

12、前对软体类、甲壳类等活饵料生物也展开了广泛的研究13-14。有关益生菌在刺参养殖中的应用也进行了较多相关研究15-17。芽孢杆菌是水产养殖业中应用最广泛的益生菌之一18。有研究表明，芽孢杆菌可以促进刺参生长，对肠道消化和免疫有显著的促进作用19。目前国内外市场多数芽孢杆菌型益生菌制剂多以芽孢形态存在，但也有部分采用液态活菌形式，而部分固体发酵产品中，则基本上为灭活的菌株20-21。本文通过在刺参饲料中添加益生菌的方式，研究了一株从刺参养殖环境中分离筛选的蜡样芽孢杆菌在三种不同状态下对刺参生长及消化和非特异性免疫相关酶活性的影响,以期为益生菌在刺参养殖中的合理使用提供理论基础。2 材料和方法2.

13、1实验材料2.1.1 菌株来源 本研究所使用的蜡样芽孢杆菌(Bacillus. Cereus)，来自中国海洋大学海水养殖实验室保种室，经分离、筛选自刺参养殖池塘，菌株编号为BC-02。实验所用的蜡样芽胞杆菌BC-02分为活菌、灭活菌及芽孢三种状态，其中活菌浓度为1011 cfumL-1；灭活菌采用甲醛灭菌法14制得，浓度为1011 cfumL-1；芽孢由青岛根源生物集团有限公司提供，浓度为31011 cfukg-1。2.1.2 刺参 实验所用刺参于购自青岛胶南慧和海珍品基地，购置后运回实验室，放入透明玻璃钢水槽( 规格为 200cm 50cm 80cm )中进行暂养驯化，共计15天。驯化期间，

14、水温控制在( 17 1 )，盐度控制在(30.0 0.1)，每天换水 1 次，日换水量约为 1/3-1/2 ，全天充气。日投喂人工配合饲料 1 次，并及时清除水槽内残饵及粪便。待驯化结束之后，挑选出规格、重量相似的活力较好的健康刺参用于实验，并将刺参初始体重控制在(5.00. 25) g。2.1.3 实验饲料 实验所用饲料为人工配合饲料，由马尾藻、鱼粉和海泥按照重量比例6.5:1:2.5配合而成，呈粉末状19。2.2 实验设计与管理养殖实验在中国海洋大学鳌山卫实验室内进行，养殖水槽体积为60L ( 53cm 28cm 34cm )，实验前先用高锰酸钾对养殖水槽进行消毒，并清洗，实验期间往水槽中

15、加入附着基，方便刺参的附着22。本实验共设置三个实验处理组，分别在基础饲料中添加活菌、灭火菌、芽孢三种不同状态的蜡样芽孢杆菌BC-02。针对每个实验处理组，各设置 107 、 109 和 1011 cfukg-1三个梯度的添加浓度。实验组BC-02采用拌饵投喂的方式添加，对照组只投喂基础饲料不添加BC-02。各个处理组分别设置 5 个重复 ，每个重复各放养刺参 10 头19。养殖期间，根据刺参体重的 10% 每天投喂 1 次饲料，添加BC-02的饲料现拌现用，饲料用量可根据刺参的吃食情况适当调整，以刺参饱食为准19。试验期间及时清除养殖槽中残饵和粪便，日换水约为 1/3-1/2，并保证每隔 7

16、d 全量换水一次。实验期间水温控制在(171)，盐度维持在(30.00.1)，全天充气，实验共持续58d。2.3 菌株消化酶活性检测实验开始前，先对菌株自身的消化酶活性进行检测，主要包括菌株淀粉酶、脂肪酶以及蛋白酶的活性检测。菌株淀粉酶活性测定采用SLB培养基23，将细菌在 (281) 点种培养 48h 后用稀碘液显色测量水解圈直径大小；菌株脂肪酶活性测定采用平板法24，将细菌在(281)经含三丁酸甘油脂的平板培养48h后用罗丹明B或者维多利亚蓝显色测量水解圈直径大小。水解圈直径与菌落直径的比值表示相应酶活力的大小；菌株蛋白酶活性测定采用酪素培养基23，将细菌在(281)点种培养48h后用三氯

17、乙酸显色测量水解圈直径大小。2.4 生长指标的测定实验周期为58d，分别在实验开始时和实验结束后对刺参进行取样并称重，并计算其特定生长率。刺参的特定生长率(SGR）计算公式：SGR (% d-1) = 100(lnDW2lnDW1)/ T其中，DW1为刺参的初始干重，DW2为刺参的终末干重，T为刺参养殖天数 25。 2.5 肠道消化酶和体腔液免疫酶活性的测定2.5.1 样品的采集和处理 实验结束时，分别从每个实验处理组中随机选取10头刺参，于冰盒上剖开，切取肠道，并抽取刺参体腔液，分别置于1.5mL 和5mL 离心管中，迅速放入液氮中冷冻，后置于超低温冰箱( -80 )保存备用19。 消化酶测

18、定之前，先称取(0.05-0.2)g刺参肠道样品并剪碎，加入4倍体积的冰生理盐水( 0.86 )，配成 20 的匀浆液，将制得的匀浆液在4、3000r / min下离心15min，取出上清液，分装待测19。测定免疫酶之前，先刺参体腔液样品解冻，在4、3000 r/ min下离心15min，取出上清液，分装待测19。2.5.2 消化酶活性测定 选取刺参肠道淀粉酶(MPS) 、脂肪酶(LPS)以及蛋白酶(PEP)作为刺参消化酶活性的评价指标。MPS活性采用淀粉酶试剂盒测定，以每克组织蛋白在37条件下与底物作用30分钟，水解10mg淀粉为一个活性单位，用U/mgprot表示；LPS活性采用脂肪酶测定

19、试剂盒测定，以每克组织在指定反应体系中与底物反应1min，每消耗1umoL底物为一个酶活力单位，用U/gprot表示；PEP活性采用蛋白酶试剂盒测定，以每毫克蛋白中含有的蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003为一个酶活力单位，用U/mgprot表示。上述使用的试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，具体测定方法参照产品说明书。2.5.3非特异性免疫酶活性测定 选取刺参体腔液的超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)以及溶菌酶(LSZ)作为刺参非特异性免疫酶活性的评价指标。SOD活性采用超氧化物歧化酶测定试剂盒，以每毫升反应液中 SOD 抑制率达到 50时所对应的SOD量为

20、一个酶活性单位，以 U/mL表示；ACP活性采用酸性磷酸酶测定试剂盒测定，以每100mL样品在37与基质作用30分钟产生1mg酚为一个活性单位，以U/gprot表示；AKP活性采用碱性磷酸酶测定试剂盒测定，以每100mL样品在37与基质作用15分钟产生 1mg 酚为一个活性单位，以 U / gprot表示；LSZ活性采用溶菌酶测定试剂盒测定，以每毫升反应液在37，pH6.2时OD450nm吸光度减少0.001为一个酶活力单位，以表示U/mL表示。上述使用的试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，具体测定方法参照产品说明书。2.6 数据处理与分析数据统计分析采用SPSS21.0软件进行，数据结果以

21、平均值标准误(meanS.E.)表示。在数据分析前，先对百分率数据进行反正弦转换，各处理组之间的差异采用单因子方差分析( ANOVA )和Duncan多重比较法进行，以 P0.05 作为差异显著水平。3结果3.1 菌株BC-02消化酶活性测定结果菌株BC-02消化酶活性测定结果见表1，从水解圈的有无及大小比较可以看出，该菌株BC-02有较弱的蛋白酶活性，未检测到芽孢杆菌的淀粉酶和脂肪酶活性。3.2 刺参生长情况实验结束时不同处理组刺参末体重情况见图1。可以看出，菌株BC-02以不同形式添加到饲料中，对刺参的生长具有不同影响。其中，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)

22、的活菌BC-02添加组刺参体重显著高于对照组(P0.05)；对于芽孢BC-02添加组，三种添加浓度下刺参体重均显著高于对照组(P0.05)。各处理组特定生长率(SGR)情况见图2。可以看出，饲料中添加不同状态的芽孢杆菌BC-02对于刺参特定生长率的影响有所不同。对于活菌和芽孢BC-02添加组，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)能显著促进刺参的生长速度(P0.05)。综合比较，在刺参饲料中添加适量浓度的活菌和芽孢BC-02，对刺参具有显著的促生长作用，但灭活BC-02的添加对刺参的生长影响不大。3.3 刺参肠道消化酶活性检测结果3.3.1 刺参肠道蛋白酶活性实验结束

23、时，不同处理组刺参肠道蛋白酶(PEP)活性见图3。可以看出，菌株BC-02不同使用状态对刺参肠道蛋白酶的影响变化规律与刺参生长规律基本一致。对于活菌BC-02添加组，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)处理组的PEP活性显著高于对照组(P0.05)；芽孢BC-02添加组中，107、109、1011cfukg-1三种添加浓度的处理组的PEP活性均显著高于对照组(P0.05)。3.3.2 刺参肠道脂肪酶活性 肠道脂肪酶(LPS)活性变化趋势与蛋白酶变化趋势基本一致（图4）。其中活菌BC-02添加组中，107、109、1011cfukg-1三种添加浓度的处理组的LPS活性

24、均显著高于对照组(P0.05)；芽孢BC-02添加组中，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)处理组的LPS活性显著高于对照组(P0.05)；灭活BC-02添加组中，只有中浓度(109cfukg-1)处理组的LPS活性显著高于对照组(P0.05)。3.3.3 刺参肠道淀粉酶活性 刺参肠道淀粉酶(AMS)活性见图5。从图可知，活菌BC-02添加组中，107、109、1011cfukg-1三种添加浓度处理组的AMS活性均显著高于对照组(P0.05)；芽孢BC-02添加组中，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)处理组的AMS活性显著高于对照组(P

25、0.05)。3.4 刺参体腔液非特异性免疫相关酶活性结果3.4.1 刺参体腔液超氧化物歧化酶活性刺参体腔液超氧化物歧化酶(SOD)活性见图6。可以看出，菌株BC-02不同状态均对刺参体腔液的SOD活性有影响，其中活菌和芽孢BC-02添加组变化规律一致，107、109、1011cfukg-1三种添加浓度的处理组的SOD活性均显著高于对照组(P0.05)；灭活BC-02添加组中，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)处理组的SOD活性显著高于对照组(P0.05)。3.4.2 刺参体腔液酸性磷酸酶活性 刺参体腔液酸性磷酸酶(ACP)活性见图7。可以看出，菌株BC-02三种不

26、同状态均对刺参体腔液的ACP活性有影响，其中活菌和芽孢BC-02添加组变化规律一致，107、109、1011cfukg-1三种添加浓度的处理组的ACP活性均显著高于对照组(P0.05)；灭活BC-02添加组中，三种添加浓度的处理组的ACP活性均显著高于对照组(P0.05)。3.4.3刺参体腔液碱性磷酸酶活性刺参体腔液碱性磷酸酶(AKP)活性见图8。由图可见，菌株BC-02三种不同状态均对刺参体腔液的AKP活性有影响，其中活菌和芽孢BC-02添加组变化规律一致，107、109、1011cfukg-1三种添加浓度的处理组的AKP活性均显著高于对照组(P0.05)；灭活BC-02添加组中，高浓度(1

27、011cfukg-1)处理组的AKP活性显著高于对照组(P0.05)。3.4.4 刺参体腔液溶菌酶活性刺参体腔液溶菌酶(LSZ)活性见图9。由图可见，菌株BC-02三种不同状态均对刺参体腔液的LSZ活性有影响。其中活菌和芽孢BC-02添加组在107、109、1011cfukg-1三种添加浓度处理组的LSZ活性均显著高于对照组(P0.05)；灭活BC-02添加组中，中浓度(109cfukg-1)和高浓度(1011cfukg-1)处理组的LSZ活性显著高于对照组(P0.05)。图9不同处理组刺参的溶菌酶活性（字母不同表示差异显著P0.05)Figure 9 Lysozyme activities

28、of A. japonicus in different treatments. Different letters indicate significant differences (P0.05) and bars represent standard errors of the means.4 讨论4.1 三种不同使用状态的芽孢杆菌对刺参生长的影响“益生菌”这一词最早是由Parker25在1974年提出的，他将益生菌定义为有助于肠道内菌群平衡的微生物和物质，而Fuller和Moriaty和Taonock等人则在此基础对益生菌的定义进行了进一步修订和扩展26-29。Verschuer等30将

29、水产用益生菌定义为可通过改变机体内或环境微生物群落、提高饲料利用和营养价值、增强宿主抗病力、改善周围环境质量，而对机体产生有益作用的活微生物添加剂。芽孢杆菌作为一种水产养殖较为常用的益生菌添加剂，目前已经得到广泛的研究与应用31。Kozasa32在1986年首次将一株芽孢杆菌并添加到水产饲料中，成功降低了日本鳗鲡(Anguilla japonica)幼苗的死亡率。Saeed等33人在印度白虾(Fenneropenaeus indicus)投喂饲料中添加一种芽孢杆菌，饲养一段时间后发现对虾体长明显高于对照组(P0.05)。丁贤34也发现芽孢杆菌对凡纳对虾(Pennaus vannamei)的特定

30、生长率有明显的促进效果。付天玺等35在饲料中添加1011cfu/kg的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)能显著促进奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticusOlaureus)的生长和饲料营养物质的利用，满足最佳生长。目前在水产养殖中应用最为广泛的芽孢杆菌益生菌主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等36。芽孢杆菌的使用方式也各样不一，有的通过直接添加到养殖水体中，有的是添加到饲料中，还可以通过饵料生物作用于养殖动物37。分离自不同的环境的菌株对不同的养殖生物的作用也不尽相同19。本研究所用的益生菌为蜡样芽孢杆菌，自刺参养殖环境中分离筛选所得。从其对刺参生长的影响看，添加活菌和芽孢状态的BC-02的处理组，刺参体重增长和特定生长率SGR均显著高于对照组(P0.05)。同时从刺参生长的实验结果看，芽孢杆菌的添加浓度在一