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1、酶工程复习资料整理第一章：（一）酶工程的概念 是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术 一、酶的分类 1.氧化还原酶：2.转移酶：3.水解酶：4.裂合酶：5.异构酶6.连接酶，7. 核酶（一）酶的组成形式1.单体酶( monomeric enzyme) ：由一条或多条肽链组成，肽链间以共价键结合的酶。2 .寡聚酶(oligomeric enzyme) ：由若干相同或不相同的亚基以非共价键结合而组成，亚基一般没有活性，必须相互结合后才有活性。3.多酶复合体(multienzyme system)

2、 ：由2个或2个以上功能相关的酶通过非共价键连接而成的、能进行连续反应的体系就是多酶复合体。（二）酶的结构特点(holoenzyme) （apoenzyme） (cofactor) 全 酶 = 酶蛋白 + 辅因子（金属离子、辅酶、辅基）金属离子无机离子 金属离子有机化合物辅酶、辅基 辅酶(coenzyme) ：指与酶蛋白结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。例如硫胺素、焦磷酸。 辅基(prosthetic group) ：是以共价键和酶蛋白结合，结合的较紧密，不能通过透析法除去，需要经过一定的化学处理才能与酶蛋白分开。四、酶的作用机制（一）酶的结构组成及活性中心 调控基团 中心外

3、必需基团 酶的结构 必需基团 活性中心 结合部位 中心内必需基团 催化部位 活性中心以外的必需基团 其它部分1、酶的活性中心(active center) ：是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。2、结合部位：酶分子中与底物结合，使底物与酶的一定构象形成复合物的基团。 酶的结合基团决定酶反应的专一性。3、 催化部位：酶分子中催化底物发生化学反应并将其转变为产物的基团。4、 4、调控基团：酶分子中一些可与其他分子发生某种程度的结合并引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用的基团 催化基团决定酶所催化反应的性质，同时也是决定反应的高效性。（二）酶作用

4、专一性机理 专一性：一种酶只能作用于一种或一类底物。表现为1.锁钥模型认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶活性部位的形状与所需作用的底物形状相吻合，它们可以象钥匙与锁一样互相匹配。此学说可以较好的解释酶的立体异构专一性；但不能解释酶的多底物现象、酶对正反方向的催化等2.诱导契合模型该学说认为酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，由于酶与底物相互诱导，使底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这个动态的辨认过程称为诱导契合。 （三）酶作用高效性机理 中间产物学说（过渡态学说（四）影响酶高效性的因素1. 邻近定向效应 2. 变形或张

5、力 3. 广义的酸碱催化 4. 共价催化（亲核催化/亲电催化） 5. 酶的活性中心为疏水区域第三节 酶的催化特点和影响因素一、酶的催化特点（一）高催化效率（二）强专一性（三）可调节性（四）活性的不稳定性二、影响酶活力的因素（一）底物浓度（二）产物浓度 正反馈调节：反应的中间产物或终产物能够起激活变构剂的作用，使酶促反应速率加快。 负反馈调节：反应的中间产物或终产物对酶起变构抑制作用，使酶促反应速率降低（三）酶浓度 在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。 当底物浓度达到饱和时，增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应的速度与酶的浓度成正比关系。（四）温度 最适温度（optimum temper

6、ature）：使酶促反应速度达最大时的温度。（五）pH六、抑制剂抑制作用：通过与酶分子上的某些必需基团结合，使这些基团的结构和性质发生改变，从而引起酶活力下降或丧失，这种作用称为抑制作用。变性作用：变性剂（七）激活剂（1）无机离子：金属离子（K+ Na+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ Ca2+）、阴离子（Cl- Br-）、氢离子（2）小分子有机化合物：某些还原剂、乙二胺四乙酸（EDTA）（3）生物大分子（主要是激活酶原） 无活性的酶原 有活性的酶 第四节 酶的活力测定酶活力：也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。

7、所以测定酶的活力就是测定酶的反应速率 酶反应速率：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。单位：浓度/单位时间酶的比活力代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。1、米氏常数Km ：当v=1/2 Vmax 时的底物浓度 Km值：是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是mol/L，与底物浓度的单位一样。 高Km值弱底物结合（k2k1） 低Km值强底物结合（k2k1）（3）不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数，只与酶的性质有关，而与其浓度无关。（4）Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH

8、条件下，一定的缓冲体系中测定得到的，不同条件下具有不同的Km值。（5）同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。 1）不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制作用非专一性不可逆抑制作用2）可逆抑制作用 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制三种可逆抑制作用的比较抑制剂结构抑制剂结合位点酶的结合能力增加底物浓度的影响Km可逆竞争性抑制与底物近似酶的活性部位不能同时结合底物和抑制剂解除抑制效应增加可逆非竞争性抑制与底物不同活性部位外的其他位点同时结合两者无影响不变可逆反竞争性抑制与底物不同活性部位外的其他位点与底物结合后才与抑制剂结合无影响变小第二章 酶的发酵工程

9、二、酶生物合成的诱导作用 诱导酶：细胞在外来底物或底物类似物诱导下合成的。 组成酶：细胞所固有的酶，在相应的基因控制下合成，不依赖底物或底物类似物而存在。诱导可分为 协同诱导：诱导物同时或几乎同时诱导几种酶的合成。 顺序诱导：先后诱导合成分解底物的酶和分解其后各中间代谢产物的酶。三、酶生物合成的阻遏作用 终产物阻遏：由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏。 分解代谢物阻遏：大肠杆菌在含有能分解的两种底物（葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，首先分解利用葡萄糖，而不分解乳糖，这是因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用乳糖的有关酶的合成。这种阻遏称为分解代谢物阻遏，或葡萄糖效应。第二节

10、 酶的发酵技术（三）产酶菌的获得1、菌种的采集 （1）胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件接近。（2）要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。（3）如果预先不了解产酶菌的来源，一般可以从土壤中分离，因为土壤是微生物的大本营。 2、富集培养（1）原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选3、菌种的分离纯化例如：筛选能产生水解酶的菌株以该酶的底物作为培养基中的主要碳源或氮源，如果菌株能产生所需要的酶，经过一定时间培养后就能分解周围的底物，从而在菌落周围形成一个透明的水解圈。如果透明圈不明显，

11、可在培养结束时加入底物的沉淀剂（或显色剂），使未被分解的底物显现出来，从而更清晰的衬托透明圈。4、产酶性能测定通常是将平板分离出来的产酶能力较强的菌株转入三角瓶内振荡培养，然后用生产上常规的测定方法对培养产物进行分析鉴定，从中找出产酶量高、性能更符合要求的菌株。5、菌种的退化与复壮三、发酵方法 液体深层发酵 固体发酵 分批发酵 连续发酵 补料分批发酵 四、提高产酶的措施（一）通过条件控制提高酶产量（二）通过基因突变提高酶产量（三）通过基因工程提高酶第三节 酶的发酵动力学 同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型第三章 酶的分离工程第一节 预处理目的：1、改变发酵液的过滤特性：如降低液体黏

12、度（加水稀释、加热、酶解），凝聚与絮凝，调整发酵液pH，加助滤剂等。2、去除发酵液中的部分杂质：如杂蛋白、无机金属离子、色素等。第二节 固液分离1、过滤分离法 低速离心（常速离心）：8000 r/min高速离心：1000025000 r/min，常带冷冻超速离心： 25000120000 r/min 差速离心：低速与高速离心交替进行，使两种以上沉降系数不同的颗粒先后沉淀，从而实现分批分离的方法。 密度梯度离心：是指将样品在密度梯度介质中进行离心，从而使沉降系数很接近的颗粒分离开来的方法。P45图3-1 等密度梯度离心：3、超滤A、微孔过滤：操作压为0.050.5 MPa，膜的平均孔径为0.05

13、10m。 B、超滤：操作压在0.111.0 MPa，膜的平均孔径为0.0010.05m。 C、反渗透：操作压达到110 MPa，膜的平均孔径为0.11nm 。4、电渗析第三节 细胞的破碎1、机械破碎法：捣碎法、研磨法、匀浆法2、物理破碎法：温差法、压差法、超声波法3、化学破碎法：有机溶剂（甲苯、丙酮等） 、表面活性剂（吐温等）4、酶促破碎法第四节 酶的分离纯化1、分子大小不同（1）离心（Centrifugation）（2）透析（3）凝胶过滤（Gel filtration）（4）超滤（Ultrafiltration）2、分子电荷不同（1）等电聚焦电泳（IFE）（Isoelectric focus

14、ing electrophoresis）（2）离子交换层析（Ion exchange chromatography）3、分子极性不同（溶解度不同）(1) 盐析（Salting-out）(2) 等电点沉淀(3) 有机溶剂沉淀(4) 萃取4、亲和力不同亲和层析：利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。第四节 酶的分离纯化1、离心2、沉淀（1）盐析沉淀法（2）等电点沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）选择性变性沉淀法（5）其它3、过滤与膜分离 粗滤：截留物质直径2m，压差 微滤：截留物质直径0.22m，压差 超滤：截留物质直径2nm0.2m压差 透析：浓度差4、萃取5

15、、色谱法（层析分离）凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 疏水层析 吸附层析等6、电泳 纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等点聚焦电泳、双向电泳。第五节 酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩 ：蒸发浓缩 超滤浓缩 胶过滤浓缩 反复冻融浓缩 聚乙二醇浓缩二、酶的干燥：1、真空干燥2、喷雾干燥 3、冷冻干燥4、气流干燥5、吸附干燥：硅胶、无水氯化钙等第四章 固定化酶与固定化细胞第二节 酶的固定化一、固定化酶的定义Immobilized enzyme：借助物理或化学的方法，将酶固定于水不溶性或水溶性载体而制成的一种酶制剂形式，它能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。三、酶的固定化方

16、法1.吸附法：利用氢键、疏水作用、离子键等作用，将酶固定在水不溶载体表面的固定化方法。 2.共价结合法：载体与酶分子之间通过共价键作用而结合，是利用最多的固定化方法之一。3.交联法：用双功能或多功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白之间，酶分子与载体之间进行交联反应，形成网络结构的固定化方法。4.包埋法：将酶分子截留在具有特定网状结构载体中的固定化方法,只适合作用于小分子底物的酶。5.无载体固定化 各种固定化方法的优缺点比较固定化方法物理吸附法离子吸附法共价结合法交联法包埋法无载体固定化制备难易易易难难易难结合程度弱中强强强强酶活力回收高高中中高高载体的再生可能可能不能不能不能不能费用低低高高

17、中高底物专一性不变不变可变可变可变可变五、固定化酶的性质1. 固定化后酶活力的变化2. 固定化对酶稳定性的影响3. 固定化酶的最适温度变化4. 固定化酶的最适pH变化5. 固定化酶底物特异性的变化6. 固定化酶的米氏常数变化三、在工业上的应用（一）在生物转化中的应用（二）在食品工业中的应用 用固定化微生物生产酸奶（三）在皮革工程领域的应用第五章化学酶工程1、定义：通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质和生物活性， 这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。二、酶化学修饰的原理基本原理：利用化学修饰剂所具有的各种基团

18、的特性，直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应，从而对酶分子进行改造。三、酶化学修饰的方法酶分子内部化学修饰1、肽链有限水解修饰2、氨基酸置换修饰3、金属离子置换修饰酶分子表面化学修饰4、酶分子侧链基团的修饰5、大分子结合修饰6、化学固定修饰 四、修饰酶的性质（一）修饰酶的稳定性提高（二）修饰酶的抗原性降低（三）修饰酶的半衰期延长（四）修饰酶的最适pH（五）修饰酶的动力学性质第二节 模拟酶一、模拟酶的概念模拟酶：就是根据酶的作用原理，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些比天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过

19、程，所以又称为人工酶或酶模型。二、模拟酶的理论基础1、 酶的催化机制2、“主-客体”化学（Host-guest chemistry） 定义：把主体与客体通过配位键或其它次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主-客体”化学。 本质：来源于酶和底物的相互作用，体现为主体与客体在结合部位的空间及电子排列的互补，这种主客体的互补与酶和其识别的底物的结合情况相类似3、 超分子化学（Supramolecular 概念：超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键的相互作用，当受体和底物分子结合成具有稳定结构和性质的实体时，即形成了“超分子”。超分子化学是一个交叉学科，涉及无机与配位化学、有机化学、

20、高分子化学、生物化学和物理化学，由于能够模仿自然界已存在物质的许多特殊功能，因此它也构成了纳米技术、材料科学和生命科学的重要组成部分。三、模拟酶的分类根据模拟酶的属性可分为：(一) 主-客体酶模型(二) 胶束酶模型(三) 肽酶(四) 半合成酶 (五) 抗体酶 (六) 分子印迹酶第三节 抗体酶抗体酶：抗体酶又称催化抗体，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。二、抗体酶的制备方法1、诱导法（稳定过渡态法）原理： 如果能制备抗某个反应过渡态的抗体，这种抗体就有可能催化该反应； 设计一种与反应物的过渡态结构相似的类似物（半抗原） 半

21、抗原和载体蛋白一起对动物进行免疫，诱导机体产生能与过渡态类似物特异性结合的抗体。2、诱导和转换设计（静电互补法） 原理： 利用半抗原和抗体间的电荷互补性，即以一个带有电荷的半抗原作为免疫原，诱导抗体结合部位的一个氨基酸残基带有互补的电荷。 抗体酶的活性部位由于带有电荷，因此可以通过酸碱或亲核催化对底物其它基团发生作用。3、引入辅助因子法（多底物类似物法） 原理：将引入某种辅因子的半抗原连接在载体蛋白上，然后对动物进行免疫以获得相应的抗体。 4、抗体结合部位修饰法（蛋白质工程技术） 原理：借助蛋白质工程技术，将催化基团引入到已有底物结合能力抗体的抗原结合位点上。5、抗体库法 原理：用基因克隆技术

22、将全套抗体重链和轻链的可变区克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片断，从中筛选特异性的可变区基因。6、拷贝法原理 用已知的酶作为抗原免疫动物，制得抗该种酶的抗体；再以此种抗体免疫动物，就可获得具有原来酶活性的抗体酶。 抗原与该抗原产生的抗体具有互补性，经过上述两次免疫，就把酶的活性部位的信息拷贝到抗体酶上，使该抗体酶能高选择性地催化原酶所催化的反应。7、相似分子诱导法 原理：在反应过渡态类似物难以合成的情况下，采用与其化学结构相似的分子（如酶的抑制剂）作为半抗原。8、天然来源抗体酶第四节 印迹酶（一）分子印迹技术的原理 以一种目标分子作为模板 周围用聚合物交联制备

23、得到固体介质 通过物理或化学手段除去介质中的目标分子 得到“印迹”下目标分子的空间结构的分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP ）2、分子印迹（molecular imprinting) ：是指制备对一个特定分子(印迹或模板分子)具有选择性的聚合物的过程，该技术又称为“主-客”聚合或“模板”聚合。（二）分子印迹技术的分类1、共价法：也称预组织法，主要由wulff及其同事创立。 2、非共价法：也称自组织法，主要由Mosbach等人创立。（三）分子印迹聚合物的制备过程1、选定印迹分子和单体2、聚合反应：在印迹分子和交联剂存在的条件下，对单体进行聚合。 3、印

24、迹分子的去除：采用萃取、酸解等手段将占据在识别位点上的绝大部分印迹分子洗脱下来。 4、后处理：在适宜温度下对印迹分子聚合物进行成型加工和真空干燥等后处理。 （四）分子印迹聚合物的特点 预定性：人们可以根据不同的目的制备不同的MIP 识别性：MIP是根据印迹分子定做的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子。 实用性：它与天然的识别系统，如酶和底物、抗体和抗原相比，具有抗恶劣环境的三、生物印迹酶 能力，表现出高度稳定性和长的使用寿命，且制备简单。 生物印迹：分子印迹的一种形式，以天然的生物材料（如蛋白质和糖类）为骨架，在其上进行印记而产生对印记分子具有特异性识别空腔的过程。第七章

25、核酶核酶 (ribozyme)：是一类具有酶特性的RNA分子，它通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂破坏mRNA的状态，从而阻断该基因的表达。 第一节 天然核酶1、按作用机制不同可分为 剪接型核酶：实现mRNA前体的自我拼接 组 I 内含子（ I 型内含子） 组内含子（型内含子） 剪切型核酶：催化自身或异体RNA的切割 剪切型核酶按作用机制不同分剪接型核酶 I型内含子 II型内含子剪切型核酶锤头核酶 自体催化 发夹核酶 异体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 按分子大小不同分小分子核酶大分子核酶1、 组I内含子（ I型内含子） 催化机制第一步：rRNA前体中的间隔序列（IVS）

26、发生折叠，形成一定的空间构象；第二步：鸟嘌呤单核苷酸的3-OH进攻切割位点5磷酸，产生游离的5外显子；第三步：游离的5外显子的3-OH进攻3切割位点的磷酸，两个外显子连接起来同时游离出带有外来鸟嘌呤的内含子。2、组内含子催化机制： 第一步：内含子里面一个保守的腺嘌呤残基的2-OH进攻5磷酸，产生5游离外显子和由3外显子与内含子构成的中间体； 第二步：5游离外显子的3游离羟基进攻3切割位点的磷酸，两个外显子连接起来，并切割下内含子。第八章 非水相酶催化第二节 有机介质中的酶促反应二、有机介质中酶促反应的影响因素（一）水（二）酶（三）溶剂（四） pH（五）温度（六）固定化（七）添加物（一）水1、水对酶分子空间构象的影响2、水对有机介质酶催化反应速率的影响3、水对酶催化反应平衡及立体异构性的影响4、体系水含量的调控 第三节 有机介质中酶的性质一、酶活性二、稳定性三、pH记忆与分子印记四、底物专一性五、反应平衡方向的移动六、酶促动力学的变化