戴安p680型高效液相色谱仪使用操作规程.docx

1、戴安p680型高效液相色谱仪使用操作规程戴安P680型高效液相色谱仪含自动进样器使用操作规程11戴安P680型高效液相色谱仪含自动进样器使用操作规程26戴安高效液相泵P680的维护保养7高 效 液 相 色 谱8高效液相色谱常见故障的断定及解决方法总汇40常见故障及日常维护48戴安P680型高效液相色谱仪含自动进样器使用操作规程11 按下稳压电源工作电源开关键至“ON状态。依次接通P680型输液泵、ASI-100自动进样器、柱温箱、检测器、电脑。2 更换蠕动泵清洗瓶中5%的甲醇(假设仪器经常使用那么建议每周更换两次，假设仪器很少使用那么每次使用前必须更换。)3 确认洗针瓶中的洗液是否太少，假设太

2、少，那么需补充或更换。洗液一般为：50%的甲醇。4 排泵内气泡4.1 拧松泵右侧的快速清洗阀反时针两圈左右。按下泵前面板右下方的“Purge键，排泵内气泡，仪器将以6.0ml/min的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5分钟将自动停顿。假设想手动停顿，那么再按“Purge键，将停顿清洗。4.2 将每个需要使用的通道分别排完气泡后，拧紧快速清洗阀顺时针拧紧，注意不要拧得过紧。5 系统联机5.1 检查确认密码钥匙已与计算机联结，鼠标左键双击桌面下方工具栏的“Chromeleon图标，翻开 Chromeleon Server Monitor，点击Start，待变色龙图标变成灰色，并显示“Chromel

3、eon Server is running idle时，关闭Server Monitor。5.2 鼠标左键双击桌面的“Chromeleon图标。双击右边方框中的“HPLC-Graphics.pan，点击泵模块下的“Settings键，将跳出泵的设定窗口，设置完成后，按右下方的“Close关闭该界面。点击自动进样器模块下的“Settings键，将跳出进样器的设定窗口，设置完成后，按右下方的“Close关闭该界面。点击检测器模块下的“Settings键，将跳出一个泵检测器的设置窗口，设置完成后，按右下方的“Close关键该画面。6 序列进样6.1 新建一个程序文件 依次点击File/New，选中“

4、Program File后,进入程序编辑向导界面。 确认泵的工作方式“Isocratic等度分析、“Ramp二元梯度分析、“Multi-Step Gradient多元梯度分析、适宜的流动相通道及高/低压极限和流速。 自动进样器的参数设置，每一个参数后面都有一个推荐值，一般不做改动。 通道的选择，设定采集一个样时需要采集的时间段Acquisition Time，也可以不从0分钟开始采集，也就是前面一段时间不采集信号。 紫外信号的详细设置，设定检测波长，波长带宽，参比波长，参比波长带宽。一般设定带宽为1nm，设定参比波长为600 nm，参比波长的带宽为1nm。 设定完成后阅读程序参数，编辑、修改不

5、适宜处，最后单击工具栏中的“保存按钮，给新建的这个程序起一个名字，假设要新建一个文件夹，可点右上方的新建文件夹，然后将这个程序文件放入其中。6.2 建立方法文件 依次点击File/New，选中“Method File后，进入方法编辑向导界面。方法文件是在进完样后采集到谱图进展处理数据时需要用到的，所以如今不需要做任何改动。不可以等谱图出来之后再去建方法文件。最好将它和刚刚建的程序文件放在同一个文件夹里。 依次点击File/New，选中建序列文件“Sequence using Wizard，后进入序列编辑向导界面。 设定样品信息.1 设定样品名称，假设待测样品溶液名字一样，只是序号是按顺序递加的

6、，可以在方框的空白处输入待测样品溶液名，并通过右边的三角箭头使用“sample Number，让软件自动加上一个序号。“Number of 为待测样品溶液的个数。“Injection per为每个待测样品溶液需要进样的次数。“Start为第一个待测样品溶液放在自动进样器上的位置，假设所测的待测样品溶液是按顺序放在自动进样器上的，那么输入第一个待测样品溶液的位置，软件会自动输入以下各个待测样品溶液的位置。“Injection为进样体积。.2 设定好后，按左下方的“Apply后，可将待测样品溶液的信息在右方以列表的方式显示出来。 设定对照品信息.1 同设定样品信息。但有时候由于待测样品太多，花的时

7、候较长，为了防止保存时间漂移，峰面积有变化，消除系统的误差等原因，需要采用间隔进样的方式进样。“Variatio standards after each unknown意思为每进几个标准溶液后进几个待测溶液，再进个标准溶液后进几个待测样品溶液。.2 设定好后，按左下方的“Apply后，可将所有样品溶液的信息在右方以列表的方式显示出来，且标准溶液在前，待测样品溶液在后。6.4 点击图标进入阅读器“Browse界面，找到编辑好的序列。在此界面可以对序列进展进一步的调整，增加或减少样品；改变样品名、样品类型、进样位置、进样量、分析程序、积分方法等参数，修改后保存序列。6.5 序列进样 假设正在采集

8、基线，那么点工具栏中蓝色小圆点，停顿采集基线，将跳出如下窗口：提示您是否保存刚刚正在采集的基线谱图。假设要保存，那么在“Save to sequence前“后选择一个保存途径。通常是不保存的，那么按右上方的“YES键停顿基线的采集。 参加进样序列：击工具栏上“Start /stop Batch开始/停顿批进样键，将跳出一个窗口，假设方框中有不需要做的序列假设有，一般为上次未做完的序列，那么选中后，点右边的“Remove键，将其移走。点右上方的“Add将需要进样的序列参加列表中。点击底下右方的“Ready Check，检查设置好的程序、方法、序列有没有错误或仪器有没有准备好。假设显示有红色感慨号

9、图标，那么说明有错误。以下列图显示的信息为需要占有多大电脑空间和需要用掉多少流动相，没有其它错误信息。单击“ok，完成检查。 开始进样：单击“Start，仪器将会自动根据软件中设定的先后顺序开始进样，直至所有的样品全部进样。假设软件中相应的位置上并没有放置样品瓶，仪器将会自动识别，并跳过该样品进下一个样品。当第一个样品进完后，将会等待第二个样品进样，这时候保存时间Retention Time显示为0.00min。7 处理数据7.1 点击控制面板上的“Browser进入需要处理数据的序列。7.2 选择定量方法点击方法文件“测试方法.qnt。 根本设置“Genernal含量的单位后面输入最后的计算

10、出来的量的单位，液相样品一般为浓度单位，固体一般要算百分含量。 积分参数设定“Detection“Minimum Area：设定最小峰面积，一般设置0.0110之间。低于设定值的将不会积分；“Valley To Valley On：设置从峰谷到峰的积分；“Inhibit Integration On：设定不积分段从什么时候开始不积分，“Inhibit Integration Off：设定不积分段从什么时候完毕不积分ON和OFF是成对使用的。；“Fronting sensitivity Factory： 前沿峰灵敏度因子，一般设为24为宜；“Tailing sensitivity Factory

11、：拖尾峰灵敏度因子，一般设为24为宜；“Rider Threshold：肩峰值。设定为100%，两分不开的峰垂直分开单独积分。 峰表Peak Table设置：在第一列中输入标样的名字；在第二列在输入相对应的保存时间；在第三列中输入一个正负范围，一般在设置值保存时间的5%；第四列为定量标准，一般为外标法External；第五列为定量类型，一般以面积来定量Area；第六列为校正类型：a) 单点校正一般做样都是单点校正，所以选第一项：过原点的直线Linear，b) 线性校正假设要做线性的话，就要选第二项：带截距的直线Linear with Offset。其它设置都不用改动。 定量表Amount Ta

12、ble.1 编辑列“Edit Amount Column在表格的下方任何一位置点右键，选中“Edit Amount Column，在“Assign standards on the后面的下拉菜单中选择“Name，右边框中将会显示有几个标样。点击左边方框下的自动生成列“Auto Generatea) 做线性的话就选择第一项.separate.，说明要生成五个不同的列。b) 做单标定量的话选择第二项.single.，说明生成一个列。在“Amount列中输入标样的浓度。校正Calibration假设有一点误差较大偏离直线较远，不想让它参与校正。比方说第一个点不想要，那么将对应的“去掉，按确定即可。

13、保存刚刚方法的更改。8 报告输出在“Browse界面下，翻开序列，双击需要处理的标准样品文件，点击菜单“View/Printer-Layout，进入需要打印的界面：类似于Excel电子表格，分好几页显示，第一页为根本谱图和数据Integration；第二页为：单标的校正曲线Calibration current peak，显示的有：线性图、相关系数Corr.、截距(offset)、斜率(slope)、相对标准偏向(RSD)；第三页为：混标的校正曲线Calibration Batch一般用不上；第四页为：峰的分析。包括：基线噪音Noise、别离度Resol.、对称性Asym.、理论塔板数Plat

14、es等；第五页为：统计表Summary，一般都需要打印；第七页为谱图的重叠Overlay print。选择适宜的报告页面，打印输出。9 关机9.1 数据采集完毕后，在控制面板检测器设定中，关灯，然后断开仪器各部件的控制，关闭检测器。9.2 按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、管路、自动进样器、进样针。确保冲洗干净后，关闭各部分电源。9.3 退出色谱工作站，关闭电脑。10 本卷须知10.1 泵 假设流动相中没有电解质即缓冲盐或酸等，最好用50%的甲醇冲洗约2040分钟后就直接用甲醇或乙腈冲洗流路约2040分钟。 假设流动相中有电解质，需要先用5%的甲醇冲洗色谱柱约60分钟后，最好用50%的甲醇冲洗约2

15、040分钟后，再用纯甲醇或乙腈冲洗流路约2040分钟。 放置了一天或以上的水相或含水相的流动相如需再用，需用微孔滤膜重新过滤。 蠕动泵清洗瓶中的5%的甲醇要求每周至少换二次。假设液相使用频率不高，建议每天使用前更换，以免水长细菌损坏泵中各组件。 为了保证P680的平安运行，必须设定高、低压极限一般安装时已设置好； 流动相制止使用氯仿、三氯代苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。假设需要使用正相系统分析样品，需要另行安装耐腐蚀的正相密封圈。 拧松快速清洗阀时，不宜拧得过松。一般拧松2圈左右即可。拧得过松流动相容易从清洗阀部位

16、流进泵头中引起报警。 使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。 没有配制脱气机的，流动相一定要超声脱气。有脱气机的，泵电源开启后，等脱气机停顿工作后再进展泵的其它操作。10.2 自动进样器自动进样器建议用50%的甲醇洗针。 每天使用自动进样器进样前都要按一下控制面板上的“wash键，仪器会自动排除定量环和针中的残留气泡。 每天洗针前要检查一下洗针瓶中是否有洗液50%甲醇。10.3 检测器 检测器的紫外或可见灯在长期翻开的情况下，一定要保证有溶液流经检测池。假设不需要做样，可设置一个较低的流速如0.05ml/min或关闭灯的电源。

17、检测器的灯一般是在流通池有溶液连续流动几分钟后才开的。假设流动池中有气泡，那么会提示漂移过大无法通过自检和校正。 检测器的氘灯或钨灯不要经常开关，每开关一次灯的寿命约损失30小时。假设仪器经常使用，可几天开关灯一次。10.4 整个系统 缓冲溶液与有机溶剂互相转换前一定要用5%甲醇清洗泵，防止盐在有机相中结晶损坏泵中各组件。 缓冲溶液的浓度不能高于0.5 mol/L，pH范围212，Cl-的浓度要小于0.1 mol/L防止腐蚀流路。 仪器长时间不用，每个泵通道和整个流路一定要用甲醇冲洗后保存，以免结晶或造成污染。 待测样品或标样在流动相中一定要易溶，否那么进样后会结晶造成定量不准确或堵塞色谱柱。

18、10.5 软件 不要轻易地在windows窗口下删除软件所在根目录或子目录下的文件，以免造成软件无法正常使用。 仪器不使用时，密码钥匙不要经常拆来拆去，容易导致密码钥匙损坏。 采集紫外信号时，假设分析物质的最大波长，那么尽量减少采集的通道个数，以免占用电脑的空间。 软件系统的配置Server Configuration在软件安装完成后，不要改动。戴安P680型高效液相色谱仪含自动进样器使用操作规程2m滤膜过滤，搬动进样器手柄于inject位置，进样，开始采集。 3.6 定量分析 在样品序列表中输入相应的取样量和稀释因子，单击任何采集完毕的样品，单击工具栏上的qnt-editor图标，设定最小峰

19、面积和积分时间，主峰名称，主峰保存时间，对照品浓度等，保存。 3.7 报告输出 单击任意采集完毕的样品，单击工具栏上的printer layout图标，进入报告编辑界面，按需要适当修改报告格式，并打印输出。 4 关机 4.1 使用完毕后，在控制面板设定中，关灯，断开检测器连接，待检测器适当冷却后再关闭检测器电源。 4.2 按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、手动进样器、进样针等。确保冲洗干净后，关闭各部分电源。 4.3 处理数据并打印报告后，退出色谱工作站，关闭电脑、打印机电源。 4.4 登记仪器使用记录和操作记录。戴安高效液相泵P680的维护保养：1、假设流动相中没有电解质即缓冲盐或酸等，最好用5

20、0%的甲醇冲洗约2040分钟后就直接用甲醇或乙腈冲洗流路约2040分钟。2、假设流动相中有电解质，需要先用5%的甲醇冲洗色谱柱约60分钟后，最好用50%的甲醇冲洗约2040分钟后，再用纯甲醇或乙腈冲洗流路约2040分钟。3、放置了一天或以上的水相或含水相的流动相如需再用，需用微孔滤膜重新过滤。蠕动泵清洗瓶中的5%的甲醇要求每周至少换二次。假设液相使用频率不高，建议每天使用前更换，以免水长细菌损坏泵中各组件。5、为了保证P680的平安运行，必须设定高、低压极限一般安装时已设置好；6、流动相制止使用氯仿、三氯代苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造

21、成对柱塞密封圈的腐蚀。假设需要使用正相系统分析样品，需要另行安装耐腐蚀的正相密封圈。7、拧松快速清洗阀时，不宜拧得过松。一般拧松2圈左右即可。拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。8、使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。9、没有配制脱气机的，流动相一定要超声脱气。有脱气机的，泵电源开启后，等脱气机停顿工作后再进展泵的其它操作。高 效 液 相 色 谱我国药典收载高效液相色谱法工程和数量比较表：方法工程数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别934150检查1240160含量测定7601173

22、87鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I概论一、液相色谱理论开展简况色谱法的别离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特Tswett在1906年研究用碳酸钙别离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此根底上开展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段

23、是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长常有几个小时。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的根底上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速开展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HS

24、LP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压压力可达150300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速流速为0.110.0 ml/min。高效可达5000塔板每米。在一根柱中同时别离成份可达100种。高灵敏度紫外检测器灵敏度可达。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高可选择固定相和流动相以到达最正确别离效果。灵敏度高紫外检测器可达，荧光和电化学检测器可达。柱子可反复使用用一根色谱柱可别离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏

25、，可以搜集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于别离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于别离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体界于气体和液体之间的一种物相为流动相常用CO2，因其扩散系数大，能很快到达平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻

26、色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶浸透色谱法(GPC和亲和色谱法。此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱别离原理高效液相色谱法按别离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法正相与反相、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法使用固体吸附剂，被别离组分在色谱柱上别离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而别离。别离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于别离分子量2001000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于别离同分异构体。2液液色谱法使用

27、将特定的液态物质涂于担体外表，或化学键合于担体外表而形成的固定相，别离原理是根据被别离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而别离。别离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体外表流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的别离和搜集复杂化。由于涂布式固定相很难防止固定液流失，如今已很少采用。如今多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法采用极性固定相如聚乙二醇、氨基与腈基

28、键合相；流动相为相对非极性的疏水性溶剂烷烃类如正已烷、环已烷，常参加乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保存时间。常用于别离中等极性和极性较强的化合物如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等。反相色谱法一般用非极性固定相如C18、C8；流动相为水或缓冲液，常参加甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保存时间。适用于别离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速开展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。

29、但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为28，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.510范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界限如氨基键合固定相。3离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在外表未端芳环上接上羧基、磺酸基称阳离子交换树脂或季氨基阴离子交换树脂。被别离组分在色谱柱上别离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有一样电荷的离子及被测组分的离子进展

30、可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而别离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被别离组分在离子交换柱中的保存时间除跟组别离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，那么离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组别离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其别离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱即C18，流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中参加310 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进展别离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。5排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直