发酵工程期末总复习.docx

1、发酵工程期末总复习发酵工程-期末总复习第一章 概论1.现代发酵工业发酵定义是:利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制造微生物菌体本身,或其直接代谢产物及次级代谢产物的过程.2.应用范围微生物菌体:面包酵母,SCP微生物酶：糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等。直接代谢产物(初级代谢产物):微生物生命活动中必需的代谢物.如氨基酸,维生素等.次级代谢产物:代谢过程中产生的,对一般生长活动并不必需的代谢物质,常在微生物停止生长以后才产生.如色素,毒素,抗生素等.微生物的生物转化：利用微生物产生的酶作用于化合物的局部结构。微生物消除环境污染微生物湿法冶金：利用微生物对某些金属氧化物的氧化还原反应。3.发酵的特

2、点=微生物的特点+发酵工程的特点微生物的特点：体积小,面积大；吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强,易变异；分布广,种类多。发酵工程的特点：反应条件温和（常温常压）；原料来源广泛并无需精制；众多反应都在同一发酵罐内完成。4.发酵的基本条件要有某种合适的微生物或其它生物细胞；保证微生物能够进行代谢的各种条件(培养基,温度,溶解氧)；微生物发酵的场所；目的产物的提取和精制。5.发酵工艺组成部分种子培养、培养基制备、产物的提取精制、无菌空气、发酵罐。6.发展历程古代发酵：只知现象,不知本质。米酒 啤酒近代发酵纯培养技术的建立。酒精 甘油 丙酮-丁醇巴斯德发现了发酵是由微生物引起的,从而使传统的经验

3、发酵变成了一门科学.布雷费尔德1872年创立了霉菌纯培养技术.汉逊1878年创立了酵母纯培养技术。科赫1881年创立了细菌纯培养技术.现代发酵：通气搅拌发酵1929弗莱明 完成了发酵技术的第二次技术转折；青霉素。代谢控制发酵1959木下祝郎 发展完成了发酵技术的第三次转折；氨基酸、核苷酸。基因工程菌发酵1970以来 引起发酵工程的技术革命；技术特点:可定向改造生物基因,按人们的意志生产产品；人生长素,干扰素,疫苗7.展望利用基因工程技术选育优良菌种；采用发酵技术大量培养高等动植物细胞；开发大型节能发酵装置,自动化将成为生产控制的主要手段；应用代谢控制技术生产各种代谢产物；发酵发生产单细胞蛋白，

4、解决粮食危机。第二章 工业微生物菌种选育1.育种的必要性发酵工业的目的是为人们提供各种各样的发酵产品，菌种的特性是发酵能否成功的关键，野生菌株不会积累过多的代谢产物，我们需要对野生菌株改造，使其符合人们的要求（高代谢产物及其它特性等）。2.育种方法自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程育种。3.菌种的筛选步骤采样 富集分离筛选产物鉴别。出发菌株采样：向菌中保藏机构购买或索取、向其它机构购买或索取、从自然界采样（包括从土壤中采样、根据微生物特点采样）。A.土壤采样：根据 土壤有机质状况、土壤酸碱度和植被状况、地理条件、季节变化。除去表层5CM左右的土层,取525CM的土样1015克(北方土壤干燥

5、,可在10-30CM处取样),装入事先准备好的容器内,编号并记录地点 土壤质地 植被状况取样时间及其它环境条件等.B.根据微生物的生理特点：产纤维素酶、产蛋白酶、产淀粉酶,糖化酶、以碳氢化合物为底物的菌种等。富集培养：根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,取样品少许加入培养基中,给目的微生物一个最适的生长环境,经过一定时间的培养,目的微生物在数量上占绝对优势,可有效地分离出所需要的菌株.分离纯化分离,包括稀释分离法和划线分离法；组织分离法（常用于病变组织或特殊组织）；控制营养和培养条件。诱变育种：包括诱变、筛选、优化环境条件。A.人工诱变育种的目的提高有效产物的产量;改善菌种特性 提高产

6、品质量;开发新品种.B.人工诱变育种的优点:能加速基因突变,可大大地提高突变株的数量.速度快 收效大 方法简单.C.诱变育种方法与步骤出发菌株的选择.菌悬液制备.诱变.突变株纯化及分离.产物活性测定.a.出发菌株的选择:选择具有一定生产能力或某种特性的菌株作出发菌株.选择纯种作出发菌株.选择菌株应考虑稳定性.采用多出发菌株.b.出发菌株的纯化 将液体培养物或从斜面移接菌体细胞到0.9%生理盐水中,按10倍稀释法,逐一稀释到10-610-5,从适当浓度的稀释管中吸取0.1毫升,于事先准备好的琼脂平板上均匀涂抹,培养后,挑取一定数量(3050个)菌落,进一步培养鉴定,最后确定遗传性状稳定菌株供诱变

7、处理.c.单孢子菌悬液制备菌悬液要求:对进行诱变的菌体要保持同步,同时又要处在最旺盛的对数期.菌悬液制备方法(细菌):把经过2024小时培养的新鲜斜面,移到装有基本培养基的三角瓶中,于37振动培养到对数期(1618小时).接着于6培养1小时, 使之同步生长.然后加入一定浓度的嘧啶和嘌呤继续培养2060分钟.置于低温(约2)10分钟.离心洗涤 .用生理盐水或缓冲溶液制备菌悬液.d.诱变物理诱变剂:紫外线 X射线 射线紫外诱变机理：引起DNA链上的两个嘧啶形成TT二聚体、嘧啶碱基或嘌呤碱基被氧化脱氨基作用、碱基中C-C键断裂，形成开环现象、核苷酸被击中后使碱基或磷酸酯游离出来、在DNA的链内或链间

8、的碱基形成交联作用。紫外线诱发微生物突变的有效波长是200-300nm,最常用的波长是253.7nm.光复活作用：把紫外线照射的微生物暴露于可见光下,可明显降低死亡率的现象。原因是光激活酶获得光能后催化TT重新分解成单体.化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂。烷化剂诱变机理：具有一个或多个活性烷基,作用于DNA的碱基或磷酸部分,导致DNA分子结构变化,引起变异；与两个鸟嘌呤形成共价键,双功能烷化剂容易引起DNA双链的交联,引起变异或死亡.亚硝酸的诱变机理：主要是直接作用于正在复制或未复制的DNA分子,脱去碱基中的氨基变成酮基,影响氢键的形成,发生变异.移码诱变剂诱变机理：DNA双

9、链上的两个碱基之间插入吖啶类化合物分子,使DNA链拉长,两碱基之间距离拉宽造成碱基插入或缺失,引起以后三联密码错位,导致移码突变.e.突变株分离和筛选微生物通过诱变因子处理,群体中产生各种突变体,其中有正突变 负突变和稳定型.需经过分离筛选,逐个挑出.突变是随机不定向的,但筛选是定向的.筛选的条件决定选育方向.常规筛选程序第一次诱变:出发菌株 诱变分离在平皿上挑选菌落(200个) 初筛(1瓶/株) 选取50株复筛(35瓶/株) 选取35株(供下次做出发菌株).第二次诱变:取上述菌株4株诱变分离到平皿上每株取100个菌落初筛(1瓶/株) 复筛选取35株供第三次诱变.筛选方法:随机筛选 平板菌落预

10、选法(根据形态变异、根据产物特性、浓度梯度法)4.菌种退化原因：基因突变、连续移代、环境条件预防：尽量减少传代、菌种纯化、采用良好的培养基和培养条件5.菌种保藏目的：保证菌种在一定时间内 不死、不衰老、不污染、保持其原有特性。原理：挑选优良纯种菌、创造适合长期休眠的条件（低温、干燥、缺氧、避光）第三章 发酵机制和代谢控制发酵1.发酵机制:微生物利用基质通过其代谢活动合成人们所需要产物的内在规律.代谢控制发酵:人为地改变微生物代谢调控机制(通过改变DNA)使有用中间或最终产物过量积累的技术.2.调控机制主要靠两个手段:酶生成量(反馈阻遏)/酶的活性(反馈抑制)。调控水平：DNA-mRAN-酶合成

11、/酶蛋白的构象变化。原理：终产物与阻遏蛋白/酶变构部位结合。特点：慢、粗/快、精确。3.营养缺陷型菌株筛选营养缺陷型：野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力,只有在基本培养基中加入缺失的因子才能生长的突变类型。培养基类别基本培养基(MM):只能维持野生型菌株正常生长的培养基.补充培养基(SM):在基本培养基中加入该菌不能合成的生长因子后的培养基.完全培养基(CM):能满足各种营养缺陷型生长的培养基.营养缺陷型菌株的分离和筛选诱发突变-淘汰野生型-检出缺陷型-鉴别缺陷种类筛选（淘汰野生型）的方法细菌：青霉素（杀死生长繁殖着的细菌）酵母：制霉菌素（与真菌细胞膜上的甾醇作用）丝

12、状菌：过滤法营养缺陷型的检出点植对照法、影印法、夹层法营养缺陷型生长谱的确定 15因子、21因子。 3.乙醇发酵在无氧条件下,酵母或其它微生物酵解生成的丙酮酸，在丙酮酸脱羧酶的作用下脱羧生成乙醛,继而在乙醇脱氢酶的作用下,接受NADH的氢生成乙醇.CH3COCOOH CH3CHO+CO2 CH3CHO+2H+ CH3CH2OH总反应：C6H12O6 2CH3CH2OH+2CO2理论转化率：(246.05/180.1) 100%=51.1%巴斯德效应：有氧条件下,酒精发酵和葡萄糖利用速度明显下降的现象。三阶段a.前期发酵:酒母和糖化醪加入发酵罐后,由于醪液中含有一定的溶解氧和充足的营养物质,酵母

13、能迅速生长到一定的水平.此时醪液中的糊精继续被糖化酶作用生成可发酵糖.26-28摄氏度b.主发酵:醪液中糖分迅速下降,酒精逐渐增多,CO2大量产生搅动酵母上下翻动与糖充分接触,使发酵进行得更彻底,发酵醪温度快速上升.30-34c.后发酵：此阶段的糖分大部分被消耗,发酵作用缓慢,温度逐渐下降.30-324.乳酸发酵同型乳酸发酵:发酵产物中只有乳酸生成.理论转化率100%。异型乳酸发酵:发酵产物除乳酸外,还有乙醇和CO2生成.两者发酵菌种不同,发酵机制也不同.5.黄色短杆菌合成赖氨酸的调节机制代谢优先生成高丝氨酸；代谢优先向蛋氨酸方向进行；蛋氨酸过量反馈阻遏酶4,3的合成；异亮氨酸过量反馈抑制酶5

14、的活性；苏氨酸过量反馈抑制酶3的活性,并且与过量赖氨酸协同抑制酶1的活性。 积累赖氨酸的菌株：A)通过基因突变使酶3失去活性得到高丝氨酸营养缺陷型,切断向苏氨酸方向的代谢流.B)在培养液中加入限制量的高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)6.积累肌苷酸IMP突变株选育选育腺嘌呤缺陷型 或腺嘌呤+鸟嘌呤缺陷型 或腺嘌呤+黄嘌呤缺缺陷型。7.谷氨酸棒杆菌合成谷氨酸的调控机制野生型菌：谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量时，就会反馈抑制谷氨酸脱氢酶，使草酰乙酸转向合成天冬氨酸。天冬氨酸过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，停止草酰乙酸的合成。正常情况下，谷氨酸无法积累。除非生成的谷氨酸不断排出细胞

15、外。理论转化率a。如果四碳二羧酸全部由乙酰辅酶A通过乙醛酸循环供给.则有:3C6H12O66丙酮酸6乙酸+6CO26乙酸+2NH3+3O22C5H9O4N+2CO2+6H2O理论转化率=2147/(3180) 100%=54.4%b。如果四碳二羧酸全部由CO2固定获得,则1摩尔葡萄糖生成1摩尔的谷氨酸.C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4+CO2+3H2O理论转化率=147/180=81.7%积累型菌的特点：a-酮戊二酸氧化能力微弱: a-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.谷氨酸脱氢酶活性强.还原性辅酶(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.异柠檬酸裂解酶活力微弱.耐高糖耐高谷氨酸.

16、CO2固定能力强.解除谷氨酸反馈抑制.具有向胞外分泌谷氨酸的能力.不利用谷氨酸.谷氨酸的分泌是由细胞膜控制控制细胞膜通透性的方法控制磷脂的合成控制细胞壁的合成选育温敏突变株A.生物素营养缺陷型作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Gly向膜外泄漏.控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.B.油酸营养缺陷型作用机

17、制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.C.添加表面活性剂或不饱和脂肪酸机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.D.添加青霉素 机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细

18、胞功能的转换.谷氨酸发酵常见问题A.谷氨酸“强制控制” 发酵为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素 高土温”或“高生物素 高青霉素”的方法.控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素 大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产.B. 谷氨酸的发酵转换当发酵条件、环境因素(如溶解氧、NH4+、PH、磷酸浓度）变化时，导致其它产物过多合成的现象就是谷氨酸的发酵转换。7.抗结构类似物的选育结构类

19、似物的特点：结构与正常代谢物相似.能替代类似物与变构酶的变构部位结合.不参加细胞的新陈代谢(如合成蛋白质等).一般是正常代谢的拮抗物.抗类似物突变株的优点可遗传性地解除代谢调节作用(反馈抑制).对不能从野生菌或营养缺陷型得到生产菌株时,可通过选育抗类似物突变株的方法育得氨基酸生产菌.假如找到合适的类似物,分离抗类似物突变株,简单易得.易于保存,不发生回复突变.抗类似物突变株筛选方法在含有类似物的培养基上,抗类似物突变株能够生长(敏感株不能生长),并且把相对应的氨基酸分泌于培养基中,促进周边敏感株生长,形成增殖圈.选取有明显增殖圈的突变株,进一步试验.机理当变构酶结构基因发生改变,使变构酶的变构

20、部位不再和类似物相结合,也不能与相对应氨基酸相结合,但其活性中心维持不变, 该突变株可以在含有结构类似物的培养基上生长，从而大量积累代谢产物,而不受反馈抑制或阻遏.第四章 培养条件1.培养基：人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物.主要由碳源、氮源、无机盐和生长因素等组成。发酵培养基的一般要求：营养物质组成比较丰富,浓度恰当,能满足菌体生长繁殖和代谢的要求,尤其要满足产物的特殊要求.采用原料理化性质相对稳定,彼此之间不能产生化学反应.黏度适中,不影响通气与搅拌的效果,有利于产物的分离和废物处理.具有适当的渗透压.大生产中选用的原材料尽量因地制宜

21、,来源丰富,质优价廉.常用碳源：葡萄糖、糖蜜、淀粉、糊精、脂肪、有机酸、其他碳氢化合物。葡萄糖：碳源中最易利用的糖。过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，导致供氧不足，使某些中间代谢物不能完全氧化，积累于菌体或培养基中，改变环境的PH值，影响发酵。当葡萄糖与其它碳源共存时，注意葡萄糖效应（二次生长现象）。糖蜜：蔗糖生产时的结晶母液，是糖厂副产物。富含糖（主要是蔗糖）、氮素、无机盐和维生素等。脂肪:具有碳源和消泡的双重功能.氮源：有机、无机有机氮源：含有氨基酸和其它有机氮化合物中的不同结构碳架,可直接用来合成生命所需要的蛋白质和其它细胞物质.因此微生物在有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛菌丝增长快.

22、豆饼粉花生饼粉鱼粉蛋白胨玉米浆等.尿素是成分单一有机氮源.无机氮源：铵盐硝酸盐和氨水等.被迅速利用后常引起PH变化。经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质,(如(NH4)2SO4),形成碱性物质的无机氮源叫生理碱性物质.如NaNO3.无机盐及微量元素常用微量元素：磷:是核酸核蛋白和ATP等物质的重要组分,也是许多酶的活性调节剂.磷酸是发酵生产中的限制性营养成分.常用的磷酸盐有磷酸二氢钾磷酸氢二钾及其钠盐.铁:铁是菌体细胞色素细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成成分,是生命活动必需元素之一;同时对多种代谢产物的生物合成有较大影响.锌镁钴是某些酶的辅酶或激活剂.微量的锌对青霉素发酵有促进作

23、用,过量时呈抑制作用.锌是链霉素发酵的必需元素,微量的锌能促进菌体生长和产物的形成.镁除了是一些酶的激活剂外,还能提高卡那霉素青霉素链霉素产生菌对自身产物的耐受性.钠钾钙虽不是微生物细胞的构成成分,但仍是微生物代谢中不可缺少的元素.钠有维持细胞渗透压的功能,钾离子能影响细胞膜的透性.钙离子有调节细胞透性的作用,还能调节培养液中的磷酸盐的含量.前体前体是指某些化合物加入发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成中结合到产物分子中去，其自身结构变化不大，产物的产量却因此有较大提高。如：青霉素发酵时加入苯乙酸及其衍生物可提高青霉素G的产量。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。用法：采用流加的方法

24、产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。酶制剂生产中有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子培养基的类型和选择孢子培养基种子培养基和发酵培养基。a.孢子培养基是供制备孢子用的.要求此培养基能使孢子迅速发芽和生长,能形成大量的孢子,但不引起菌种变异.一般孢子培养基中的基质浓度(特别是有机氮)要低些,否则影响孢子的形成.无机盐浓度适量,影响孢子的数量和质量。b.种子培养基 是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的.要求营养成分易被菌体吸收利用,同时还要比较丰富和完整,其中氮源和维生素含量略高一

25、些.在设计种子培养基时还要考虑与发酵培养基组成的关系,这样种子进入发酵罐后很快适应发酵环境.c.发酵培养基供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的.要求此培养基的组成丰富完整,营养成分浓度适中,利于菌体生长及合成大量的代谢产物.发酵培养基还应考虑在发酵过程中的各种生化代谢的协调,使发酵液的PH保持相对稳定.培养基成分选择a.微生物的同化能力，及原料的经济性；b.选用适当的碳氮比；c.碳源(氮源)中快速碳源(氮源)和慢速碳源(氮源)之比；d.pH的要求：酸性物质和碱性物质的组合。2.氧的供需比耗氧速率(呼吸强度):单位质量的细胞(干重)在单位时间内的耗氧量.用Qo2表示,单位为:mol O2/(kg

26、干细胞 S)摄氧率:单位体积培养液在单位时间内耗氧量. 用r表示,单位为:mol O2/(m3 S)r=Q O2X 其中 X细胞浓度,kg/m3临界溶氧Ccr：当溶氧浓度增加到一定程度,菌体的呼吸强度保持恒定,这一溶氧浓度叫临界溶氧Ccr。氧传递速率NA=KG(P-P*)=KL(C*-CL).单位体积发酵液氧传递速率OTR=NAa= KL(C*-CL) a=KLa(C*-CL)a为单位体积发酵液中气液接触面积Kla:以氧浓度差为推动力的体积溶氧系数影响氧传递的主要因素A.影响(C*-CL )的因素:a.增加罐压可提高C*,但同时也增加了CO2的浓度, 对设备耐压要求提高.b.增加通气中的氧含量

27、(用纯氧),成本提高.B.影响Kla的因素:装液量和摇瓶机的种类.摇瓶装液量，一般取1/10左右.对于发酵罐，可增加搅拌速率：a.搅拌能把大的气泡打成小气泡可增加接触面积,且小气泡上升速度慢,因此接触时间长.b.搅拌使气泡不是直线上升而是曲线上升,延长了气泡运行路线,增加气液接触时间.c.搅拌使发酵液呈湍流运动,减少气泡周围液膜厚度,减少液膜阻力,增加溶氧量.d.搅拌使菌体分散,避免结团. e.增加通气量,增加气液比表面积3.灭菌定义：用物理或化学的方法杀死或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。为什么灭菌（杂菌对发酵的影响）杂菌消耗发酵底物或产物.杂菌改变发酵液的理化性质,导致生化反应异常,

28、产物提取困难,产品质量下降.发生噬菌体污染,微生物细胞被裂解,生产失败.防止杂菌污染的措施使用培养基和设备需灭菌.好气培养过程使用的空气应经除菌处理.设备严密,反应器内部压力高于环境压力.培养过程加入物料应保证无菌.使用无污染的纯种.常用的灭菌方法A.干热灭菌原理：微生物由氧化作用而死亡.条件：一般为160下1小时左右.特点：穿透力较差,常用于器械、材料灭菌.B.湿热灭菌原理:利用饱和蒸汽灭菌,冷凝时放出大量的冷凝热使蛋白质变性而杀死微生物.条件:120维持20-30分钟.特点：蒸汽穿透力强,灭菌效果可靠,常用于培养基灭菌.C.化学药剂灭菌原理:与微生物发生化学反应而具有杀菌作用.常用化学药剂

29、:甲醛乙醇 高锰酸钾 环氧乙烷、石炭酸、新洁尔灭等.常用于器械环境等的灭菌,不能用于培养基灭菌。D.紫外线灭菌穿透力低,主要用于表面消毒和空气灭菌.E.过滤除菌培养基的灭菌（湿热灭菌）微生物受热死亡定律（对数残留定律）:对培养基进行湿热灭菌时,培养基中微生物受热死亡的速率与残留活微生物数量成正比.开始灭菌时(t=0),培养基中活微生物为N0,灭菌t时间后活微生物为N，则N=N0 * e（-kt次方）。灭菌时间取决于污染程度(N0)灭菌程度(N)和k值.随着温度的上升,灭菌速率常数增加倍数大于热敏性培养基破坏速率常数的增加倍数.也就是说,温度升高,菌死亡速率上升大于培养基破坏速率上升.结论:达到

30、相同的灭菌效果,提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间,并减少培养基的破坏.培养基分批灭菌分批灭菌就是将配制好的培养基输入到发酵罐内,用蒸汽加热达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间,再冷却至发酵要求的温度.也称实罐灭菌（实消）.优点:不要其它附属设备,操作简便.缺点:加热和冷却时间较长;对蒸汽要求不稳定；营养成分有一定损失;罐利用率低.连续灭菌(连消)连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐输送的过程中,同时进行加热保温(灭菌) 冷却。优点:1) 可采用高温快速灭菌工艺,营养破坏少; 2) 发酵罐非生产占用时间缩短,利用率提高;3) 热能负荷均匀,适合自动化控制.缺点:1)不适于黏度大颗粒多的培养基灭菌; 2) 连消设备投资增加,增加操作环节培养基的冷却经过灭菌的培养基可以利用喷淋冷却器真空冷却器板式冷却器等设备冷却.冷却好的培养基进入灭过菌的发酵罐中准备发酵.无菌空气制备空气中微生物大多为细菌和芽孢,微生物在空气中极少单独游离存在,基本附着于灰尘液滴等颗粒表面上.除去这些颗粒即可除掉微生物.过滤除菌过滤介质按其孔隙大小可分为两类:一类是孔隙小于细菌和孢子,当空气通过时,微生物被组留于介质一侧,这种介质称为绝对