第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则.docx

1、第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则第二代测序技术检测试剂质量评论通用技术指导原则一、 序言本指导原则主要针对第二代测序（ next generation sequencing，NGS）技术检测试剂（以下简称“ NGS 检测试剂”）产质量量提出指导性要求，波及基根源则、主要原资料、检测流程及性能评论等方面。本指导原则是对公司和查验人员的指导性文件，但不包含注册审批所波及的行政事项，亦不作为法例强迫履行，假如有能够知足有关法例要求的其余方法，也能够采纳，可是需要供给详尽的研究资料和考证资料。应在依照有关法例的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法例和标准系统以及目前认知水平下制定的

2、，跟着法例和标准的不停完美、科学技术的不停发展，其有关内容也将进行合时的调整。二、 合用范围本指导原则合用于鉴于 NGS 技术的检测试剂的质量评论。 NGS 检测试剂的预期用途包含但不限于以下内容：肿瘤有关基因异样、遗传疾病相关基因异样、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。 此类检测试剂波及的 NGS 技术包含靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜伏生物体的基因组进行测序。原则上不建议公司应用全基因组测序进行检测，假如公司应用全基因组测序技术，应进行充足的技术合用性

3、考证并提交报告。待测样本能够是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分别培育物（如血培育物、痰培育物等），检测对象能够是脱氧核糖核酸（DNA ）、核糖核酸（ RNA ）或二者的混杂物。本指导原则尽可能覆盖所有的 NGS 技术原理和测序平台， 所议论和描绘的内容不限于某个特定的 NGS 检测试剂。但鉴于 NGS 技术向来在不停升级和更新，可能会有本指导原则未能波及的新技术。三、 基本要求（一） 基根源则1.NGS 检测试剂的生产公司应获取医疗器材生产同意证 。研制、生产用的各种原料、辅料等应拟订其相应的质量标准，并应切合有关法例的要求。2.试剂生产公司生产质量管理系统应切合医疗器材生产质

4、量管理规范及医疗器材生产质量管理规范附录体外诊疗试剂的要求，并应通过医疗器材生产质量管理规范体外诊疗试剂现场检查指导原则 的核查。3.试剂生产公司应拥有与其技术要求相适应的人员、厂房、设备和仪器设备以及适合的生产环境。成立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物件应当单向流动，以最大限度地防备实验过程中样本之间的污染和防止扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产公司应成立切合生物安全要求的设备和举措。（二） 主要原资料NGS 检测试剂的主要原资料包含实验原资料和数据剖析原资料。实验原资料包含引物、探针、酶、参照品或标准品等，公司应供给尽量完好的研究资料，如选择与根源、制备过程、质量剖析

5、和质量标准等；数据剖析原资料包含数据库（参照序列）、生物信息学剖析软件及数据储藏中心等。数据剖析原资料能影响检测结果，公司应供给尽量完好的研究资料，如数据库（参照序列）的溯源性、生物信息学剖析软件的算法以及数据储藏中心的安全性与稳固性等。关于实验原资料，若公司自己生产，其生产工艺一定相对稳固；若来自市场（从其余单位购置），应供给的资料包含：对供给商审查的有关资料、购置合同、供货方供给的质量标准、出厂检定报告，以及该原材想到货后的质量查验资料。原资料或其供给商发生更改，应依照国家有关法例的要求进行更改申请，并从头对产品进行性能考证。关于数据剖析原资料，若公司自己供给，应拥有完好的生物信息学剖析软

6、、硬件能力，拟订相应的开发、保护及升级等方案；若来自市场（购置服务或产品），应供给相应的考证资料及后续的保护、升级等方案资料。如资料发生更改，应从头对产品进行性能考证，并依照国家有关法例的要求进行更改申请。建议公司供给的详尽资料包含但不限于以下内容：1.核酸提取、分别及纯化组分的主要构成、原理介绍及有关的考证资料，需覆盖产品检测波及的各种本种类。2.测序言库建立组分的主要构成、原理介绍及有关的考证资料建立测序言库的主要原料（脱氧三磷酸核苷、接头序列、连结酶、聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶、引物、探针、接头及其余主要原料）的选择、制备、质量标准及研究资料。如以上原资料来自市场，公司可供给供给商出

7、具的质检报告。如供给商供给的原资料为混杂系统，可供给针对混杂系统的质检报告。1.1 脱氧三磷酸核苷（ dNTP）核酸的构成成分，包含： dATP、dUTP、dGTP、dCTP 和 dTTP；建议提交对纯度、浓度及保留稳固性等的考证资料。1.2 引物、探针及接头引物、探针及接头均是由必定数目的 dNTP 构成的特定序列。探针带有特定的标记物，能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测和捕捉。接头包含条码（ barcode）或标签（ index），用于将待测核酸与测序载体连结、划分不一样根源的样本等。建议公司提交序列选择、制备方法、质量标准，以及对分子量、纯度、保留稳固性、功能性实验等的考证

8、资料。假如为外购，需供给合成机构出具的合成产物的质检证明。1.3 连结酶、聚合酶、逆转录酶及限制性内切酶连结酶、聚合酶、逆转录酶及限制性内切酶应拥有相应的酶活性。建议提交酶活性、热稳固性及工作效率等考证资料。3.参照品或标准品原料选择、制备、定值过程、稳固性研究及性能验证等资料。4.核酸类检测试剂的包装资料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（ DNase）和核糖核酸酶（ RNase）污染，建议提交相应检测报告。5.数据库（参照序列）数据库（参照序列）用于 NGS 检测试剂的生物信息学剖析，协助测序比对拼接和测序结果确认。建议公司提交数据库（参照序列）的溯源信息、数据库种类（当地数据库、在线数据库）、完好

9、性、及时性、保护以及升级方案等资料。6.生物信息学剖析软件用于对原始测序结果进行剖析并报告最后检测结果。建议公司提交分析软件的版本、算法、性能考证以及升级方案等资料。7.数据储存中心用于储藏原始和经过剖析后的检测结果，能够是当地或云储藏中心。建议公司提交数据储存中心的安全性、稳固性、保护与升级方案以及异样状况处理方案等资料。（三） 检测流程NGS 检测试剂的检测流程能够分为样本采集、样本制备、测序、生物信息学剖析及报告和数据库管理等五个环节。公司在设计开发过程中应充分考虑每个环节的质量控制，并进行考证。1.样本采集样本能够为人体样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分别培育物（如血培育物、

10、痰培育物等）。样本的获取及预办理方式、保留条件及限期（短期、长久）、运输条件等如有通用的技术规范或指南，则应依照，并引用；若没有通用的技术规范或指南，则公司应当建立自己内部的标准操作流程， 以保证样本的质量， 而且防备样本间的混杂与交错污染。不一样种类的样本所抽提的核酸的质量可能有所差别，关于每一种种类的样本，应当明确检测所需样本的用量。如样本不切合要求，应从头取样。公司需明确表记出以下内容，包含产品合用的样本种类、采集时间、采集部位、采集方式、采集量及保留和运输条件等内容。样本的采集时间的选择需考虑能否受临床症状、用药状况等要素的影响；采集部位应试虑样本的代表性、操作的难易程度及安全性等要素

11、；采集方式应详述详细的操作方法或列出有关操作指南文件以指导使用者（含图示）；公司依据产品预期用途，设计详细的采集量标准， 公司应明确采集量判断标准及方法；保留和运输条件应保护样本中的核酸， 公司应明确样本的保留条件 （温度、湿度等）及限期（短期、长久）、运输条件（温度、湿度等）及频频冻融限制等。2.样本制备2.1 核酸提取、分别及纯化样本中核酸的提取、分别及纯化的主要目的是为了富集核酸浓度并保证核酸序列的完好性。 公司应在 NGS 检测试剂的设计开发过程中对配套使用的核酸提取、分别及纯化试剂进行般配性考证，以保证其性能知足查验的需要。公司应明确检测所需核酸的最小用量。公司应当建立核酸抽说起抽提

12、后质量控制的书面标准操作流程，并依据性能考证结果在此给出用于扩增试验的核酸溶液浓度范围要求，以保证核酸样本的质量与浓度切合要求，而且防备样本间的混杂与交错污染。企业应当对抽提的每一次核酸样本的各种质控参数有详尽的记录，建议包含但不限于核酸体积、质量、浓度、纯度及完好性等。核酸浓度、纯度检测方法包含但不限于分光光度法、荧光法等；核酸完好性检测方法包含但不限于琼脂糖凝胶法、及时荧光定量 PCR 法等。假如提取、分别及纯化的核酸样实质量不切合要求，应从头取样或扩大样本量再进行核酸分别 /纯化。2.2 靶向序列富集及测序言库建立靶向序列富集是指靶向性扩增必定大小的核酸片段，公司应付富集原理及方法进行详

13、尽描绘。公司应拟订标准操作流程及质量控制方案，记录包含靶向序列片段的浓度、纯度及大小等参数。公司依据详细的测序平台的性能特色，对核酸序列进行片段化办理，片段的长短应切合后续测序的要求，片段化方法包含但不限于超声法、酶切法等。公司应拟订核酸序列片段化操作流程及质量控制方案，对经过片段化的核酸短序列的浓度、纯度及大小等参数进行检测并详尽记录。2.3 增添接头（条码或标签）测序言库中的短核酸片段需要与测序载体连结后才能进行测序反响，这一连结过程需要先给短核酸片段增添接头。 NGS 技术能够实现将多个来源不一样的样本混杂后在一个测序反响中同步检测，为了划分这些样本，通常采纳在每一个原始样本的测序言库中

14、加上独一的寡核苷酸标签的方法进行标记，这些寡核苷酸标签被称为条码或标签。条码和标签能够包含于接头序列内，也能够独立于接头序列。增添接头能够是独立的步骤，也能够在靶向序列富集过程增添。公司使用条码或标签时， 需充足考证并知足测序所需的质量要求， 如测序深度、覆盖度等条件。同时，公司应付潜伏的问题进行充足研究，包含但不限于：条码检出率的平均性、条码交换比率以及条码间相互污染或扰乱等要素。公司应报告有效的条码或标签数目，并对每个条码或标签的序列及其地点有详尽、清楚的记录。1.测序1.1 测序平台目前商业上常用的第二代测序平台依据测序原理可分为光学技术(Illumina 公司、华大基因公司为代表）和半

15、导体技术（Thermo 公司为代表）。每个测序平台都有各自的特异性参数，包含仪器大小、通量、读长、运转时间及测序成本等， 公司应联合详细的临床应用需求选择适合的测序平台。1.2 测序及碱基读取公司应依据所采纳的测序平台，选择适合的参数指标对测序质量进行监控，拟订相应的管理制度及质量标准，并明确失控状况下的纠正举措。公司应依据详细应用状况，如测序地区的大小及序列特色等要素确立测序所需要的覆盖度及深度。在测序过程中，公司应成立标准操作流程及质量控制方案监控整个测序过程中间的测序质量。 公司应依据详细的预期用途，拟订产品的测序覆盖度和深度，并供给充足的理论依照及考证结果。碱基读取是指辨别一段基因序列

16、片段每一个位点的核苷酸的过程。不一样测序平台拥有不一样的测序偏好性，可影响碱基读取过程中的错误种类与比率。应用软件能够除去或部分抵消测序偏好性的影响，提升碱基读取的正确性。碱基读取后，公司应付每个碱基读取的质量进行评估。若碱基读取质量有通用标准，则应依照并引用；若没有通用标准，可依据详细应用状况拟订碱基读取质量评论标准及剖析方法，并供给充足的理论依照及考证结果。2.生物信息学剖析及报告公司应付生物信息学剖析流程有完好的记录，成立完美的生物信息学剖析软件的版本控制方案。公司应成立生物信息学剖析流程标准操作流程及质量控制方案，保证测序数据的剖析、解读及报告的正确性与谨慎性。生物信息学剖析应报告拥有

17、明确临床指导意义的结果。2.1 序列比对拼接序列比对是指利用生物信息学软件，将短的测序片段与参照序列进行比对后达成拼接的过程。参照序列应拥有明确溯源性，能够是全基因组序列或基因片段序列。若预期用途为检测未知病原微生物，难以提早确立参照序列，能够将测序结果进行相互比对，在此基础上达成长序列的拼接。不一样的序列比对软件的正确性、特异性及比对速度等方面均有差别，公司需依据详细需要进行选择。公司需要评估序列比对的质量，若比对证量有通用的标准，则应依照，并引用；若没有通用的标准，则公司应当设立自己内部的标准，以保证比对结果的正确性。2.2 待测基因序列确实认决定检测结果正确性的要素包含但不限于测序平均度

18、、覆盖度和测序深度等。一般地，测序平均度越好，覆盖度越广，深度越深，待测基因序列的拼接结果越正确。 待测基因序列中某些特别地区的测序深度可能很低，可据此设置产品的最低检出限。公司需要对样本测序结果各个位点的测序覆盖度和深度有明确的计算方法和详尽的描绘。2.3 文件格式生物信息学剖析结果的输出格式有好多种，可是不论何种格式的文件一定包含文件构造和数据组织形式的说明，以及其余格式文件和生物信息学剖析软件的兼容性说明。建议使用通用的文件格式，如比对结果使用“.bam”文件或其余，测序结果使用“ .fastq”文件或其余。假如公司采纳自己内部的标准格式文件，应成立该标准格式的详尽说明，并注明该文件格式

19、与其余格式的兼容性及相互变换的方法。2.4 检测结果解读与报告若预期用途为检测人源基因，报告中应明确报告说明书中预期用途与检测范围涵盖的变异位点与变异种类以及相应的遗传说明。建议若预期用途为检测病原微生物，检测结果应明确测序样本中能否含有待测病原微生物。假如是分型检测试剂和耐药突变检测试剂还要明确报告病原微生物的型别及耐药突变位点信息。报告中建议包含但不限于明确的检测结果， 检测方法及限制性等内容。原则上严禁报告中出现高出产品预期用途的检测项目及结果。公司应拟订明确的检测结果解读与报告的标准操作流程，对不明确的检测结果以及非预期检测结果应有详尽明确的处理方案。3.数据库（参照序列）及数据储藏数

20、据库（参照序列）的易用性、正确性及全面性等要素关于检测结果的正确解读极为重要。公司应联合产品的详细使用状况选择数据库（参照序列）并明确其溯源性。不论选择何种种类的数据库，公司应付最后的检测结果负责。若公司使用自建的数据库，应拟订完好的保护方案（及时和按期保护方案）对数据库内容进行补充或剔除，进而保证数据库的正确性及全面性。NGS 检测产生的数据量巨大，公司应当拟订适合的数据储存方案。数据储存方式可为当地或云储存，不论选择哪一种方式，公司应充足考虑数据储存的时限性、安全性及稳固性等要素。关于已储藏数据的从头接见与剖析，公司应进行详尽记录（如接见时间，接见人员、接见内容及接见目的等信息）。关于已储

21、存的数据，原则上同意对其进行鉴于新预期用途的重复剖析，但严禁出具新的检测报告。（四） 性能评论1.核酸提取、测序言库建立核酸提取的完好性和纯度以及测序言库建立的质量都能影响检测结果，所以应付上述步骤进行质量控制。建议的质量控制要素包含但不限于以下各项：用于核酸提取的样实质量、体积；核酸浓度及核酸定量方法；核酸纯化的质量及检测方法；测序言库的核酸质量、浓度及片段大小等。2.阴性、阳性参照品1.1 预期用途为检测人源基因阴性参照品应涵盖产品说明书中的预期用途与检测范围的野生型样本，检测结果应为阴性；阳性参照品应涵盖产品说明书中的预期用途与检测范围的变异型样本，检测结果应为阳性；1.2 预期用途为检

22、测病原微生物阴性参照品应包含与待检病原微生物种属邻近、临床症状相像的病原微生物，且应混入适当（参照临床水平）的人源基因组。相应检测结果应为阴性；阳性参照品应包含产品说明书中预期用途与检测范围待检病原微生物，且应混入适当（参照临床水平）的人源基因组。相应检测结果应为阳性。3.最低检出限建议能够从扩增反响终系统核酸浓度或基因变异序列所占百分率双方面对最低检出限进行评论。 NGS 检测试剂拥有同时检测多个检测位点或靶点的能力，可将多个最低检出限参照品混杂进行检测，但应分别报告各个位点或靶点的最低检出限结果。若预期用途为检测人源基因，最低检出限参照品应覆盖所有基因变异种类；若预期用途为检测病原微生物，

23、最低检出限参照品应覆盖所有待测病原微生物。建议最低检出限参照品优先使用临床获取的生物样本（细胞系、病原微生物等）；关于某些难以获取的样本（如稀有基因种类、难以分别培育的病原微生物等），能够使用核酸模拟样本（如假病毒、核酸片段、质粒等）。使用病原微生物或核酸模拟样本作为参照品时，应混入适当（参照临床水平）的人源基因组。4.精细性关于定量检测试剂，建议观察试剂的标准差或变异系数；若为定性检测试剂，可不进行观察。 建议从以下方面对 NGS 检测试剂的精细性进行评价：1.1 对可能影响检测精细性的主要变量进行考证， 还应付第二代测序仪、操作者及地址等要素进行有关的考证；1.2 建议精细性评论方法考虑以

24、下检测要素， 包含检测周期、 检测次数、检测方式（批内、批间）以及检测人员数目等；1.3 若预期用途为检测人源基因， 用于精细性评论的参照品建议覆盖低频次样本；若预期用途为检测病原微生物，用于精细性评论的参照品建议覆盖弱阳性样本。5.扰乱物质公司依据试剂盒所采纳的样本种类，确立潜伏的扰乱物质，并进行充足考证。考证扰乱物质时，建议考证的项目包含但不限于以下项目：1.1 引物之间的相互扰乱对检测结果的影响；1.2 潜伏的 PCR 扰乱物质对检测结果的影响；1.3 若预期用途为检测病原微生物， 应分别检测目标病原微生物存在和不存在的状况下，非目标病原微生物（种属邻近、临床症状相像）对检测结果的影响，

25、以及人源基因组对检测结果的影响。6.其余问题6.1 若产品合用的样本种类不只一种， 应付所波及的样本种类的合用性进行评估；6.2 为保证检测结果的正确性， 公司应依据不一样测序平台的特征确立适合的测序覆盖度及深度，并进行充足考证；6.3 生物信息学剖析软件及数据库能直接影响检测结果， 所以应明确版本信息或最后保护日期。公司进行软件或数据库升级后，应评估对测序结果的潜伏影响，以及能否需要对既往测序结果从头剖析；6.4 关于合用多个仪器的产品， 应供给所有合用型号仪器的性能评估资料。不一样型号仪器配套的测序试剂可能不一样，且测序试剂的性能直接影响检测试剂的整体质量，建议供给测序试剂的质量控制要求。

26、四、 草拟单位本指导原则由中国食品药品检定研究院医疗器材检定所体外诊疗试剂二室草拟达成。五、 参照文件1.体外诊疗试剂注册管理方法 ,（国家食品药品监察管理总局令第5 号）， 2014 年 07 月 30 日。2.中国生物制品规程（ 2000 年版），化学工业第一版社。3.Guidelines for Diagnostic Next-Generation Sequencing. European Journal of Human Genetics, 2015, 24(1):1584-1589。4.Next-Generation Sequencing for Infectious Disease

27、 Diagnosis and Management: A Report of the Association for Molecular Pathology. The Journal of Molecular Diagnostics, 2015, 17(6):623-634。5.ACMG Clinical Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing. Genetics in Medicine, 2013, 15(9)。6.College of American Pathologists Laboratory Standards for

28、Next-Generation Sequencing Clinical Tests. Archives of Pathology &Laboratory Medicine, 2014, 139(4)。7.Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved GuidelineSecond Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute.NCCLS, MM3-A2, Vol26 , ISBN 。8. Quantitative Molecular Methods for

29、 Infectious Diseases; ApprovedGuideline. NCCLS, MM6-A, Vol. 23 . ISBN 。9.Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute. NCCLS, MM17-A, , ISBN 。10.Translating Cancer Genomes and Transcriptomes for Precision Oncology. CA:

30、A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66:75-88.附录名词解说1.脱氧核糖核酸（ DNA ）核酸的一种。是由特别序列的脱氧核糖核苷酸单元（ dNTP）构成的多聚核苷酸，起携带遗传信息的功能。 DNA 为一种双链分子，经过核苷酸碱基对间较弱的氢键维系。 DNA 包含的 4 中核苷酸包含：腺嘌呤（ A）、鸟嘌呤（ G）、胸腺嘧啶（ T）和胞嘧啶（ G）。人类存在两种种类的 DNA ：来自细胞何种染色体的基因组 DNA （gDNA ）和线粒体 DNA 。2.核糖核酸（ RNA ）核酸的一种。是与 DNA 近似的单链核酸，由核糖核苷酸依照必定的次序摆列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于细胞质和细胞核中，在细胞的蛋白质的合成和其余化学活动中起重要的作用。 RNA 分子包含信使 RNA （mRNA ）、转运 RNA （tRNA ）、核糖体 RNA （rRNA ）和其余小 RNA 等多种种类，分别履行不一样的功能。 各种 RNA 的混杂物称为总 RNA 。3.富集（ enrichment）经过特定的方法使得混杂细胞或核酸样本中待测核酸的比率增添，比如能够将不想检测的核酸成分选择性去除、或许对待测核酸成分进行选择