菌种分离与多种混养菌.docx

1、菌种分离与多种混养菌中文题目：铁矿区功能菌的分离与多菌种混合培养条件的研究 外文题目：STUDY ON ISOLATION OF FUNCTIONAL BACTERIA AND CONDITIONS OF MULTISTRAINS MIXED CULTURE IN IRON MINING AREA毕业设计（论文）共 54 页（其中：外文文献及译文 25 页） 图纸共 0 张 完成日期 2013年 6月 答辩日期 2013 年 6月摘要铁矿排石场长期以来没有进行土地复垦和再利用规划，矿山废弃物的排放和堆存带来了一系列影响深远的环境问题，随着这些问题的出现，矿业废弃地的生态恢复和开发利用变得尤为重

2、要。本研究以本溪北台露天铁矿排石场自然恢复地的土壤为实验材料，采用传统的平板培养法进行自生固氮菌、解磷菌和解钾菌的筛选。利用比浊法，以混合功能菌的生长量作为标准，对多菌种混合培养的条件进行单因素试验，并利用正交设计方法确定最佳的培养条件。研究表明，试验分离筛选出自生固氮菌4株、解磷菌3株、解钾菌3株；三种土壤功能菌的最佳培养条件是，培养基pH 7.5，接种量6%，培养时间4d；三种因素对多种混合菌种生长量的影响大小排序为：培养时间 培养基pH 接种量。本研究将为矿区微生物研究、铁矿排土场生态恢复和土地资源合理利用提供一定的科学依据。关键词：铁矿区；自生固氮菌；解磷菌；解钾菌；培养条件Abstr

3、actIron mine dump has not been taken action about land reclamation and reuse planning for a long time. The disposition of mining wastes has brought serious environmental problems. With the emergence of these issues, ecological restoration and exploitation of the mining wastelands have become particu

4、larly important.In this study, by the traditional plate culture method, azotobacter, phosphobacteria and potassium bacteria were isolated from natural restoration soils in Benxi Beitai Iron open-pit mine dump. By turbidimetry, growth mixed bacteria was used as the standard. Single factor experiment

5、was conducted about the condition of multi-strain culture. And the best culture condition was determined with orthogonal design method.The results showed that four strains of azotobacter, three stains of phosphobacteria and three strains of potassium bacteria were isolated. The optimum culture condi

6、tion of three kinds of soil bacteria was culture pH of 7.5, inoculation of 6%, culture time of four days. The order of three factors on affectting mixed bacteria growth is culture time pH inoculation. This study will provide a scientific basis for microbial research, ecological restoration and land

7、rational use in iron.mine area.Key words: Iron producing area；Azotobacter; Phosphobacteria; Potassium bacteria; Condition of culture目 录1引言 11.1矿业废弃地对环境的影响 11.1.1破坏生态平衡 11.1.2破坏地表景观 21.1.3有害物质扩散 21.1.4侵占土地资源 21.1.5地质灾害频发 31.2土壤中微生物的作用 31.2.1土壤微生物参与物质循环 31.2.2土壤微生物改善土壤结构 31.2.3土壤微生物促进植物生长 41.3微生物在土壤环境

8、修复中的作用 51.3.1污染物的微生物降解及转化 51.3.2微生物的生物修复 61.4国内外土壤微生物研究现状 71.4.1国内土壤微生物研究现状 71.4.2国外土壤微生物的研究现状 81.5 本文的研究目的和意义 92材料与方法 102.1试验材料及仪器、试剂 102.1.1样品的采集 102.1.2主要仪器与试剂 102.2技术路线 122.3操作步骤 132.3.1土壤功能菌的分离与纯化 132.3.2功能菌的筛选 142.3.3功能菌的富集培养 152.3.4种子液的制备 162.3.5混合菌种培养液光谱特性的研究 162.3.6混合菌种培养条件的单因素试验 162.3.7正交试

9、验 173结果与分析 183.1土壤功能菌的分离与纯化 183.2功能菌的筛选 193.3混合菌种培养液光谱特性 203.4单因素试验 203.4.1培养基pH对混合菌种培养效果的影响 203.4.2接种量对混合菌种培养效果的影响 213.4.3培养时间对混合菌种培养效果的影响 213.5正交试验 224讨论 244.1固氮菌、解磷菌和解钾菌的分离 244.2固氮菌、解磷菌和解钾菌的混合培养 244.3影响微生物生长的培养条件 255结论 26参考文献 27致谢 29附录A 译文 30附录B 外文文献 431引言当前，我国经济己由飞速发展转为持续稳定的增长，我们对经济发展的认识已由单一的追求经

10、济增长转变为寻求经济、环境和社会的统一协调发展。国家和社会对生态环境质量的改善也越来越重视。矿业废弃地是人类为获得矿产资源发展经济而对土地进行剧烈改造的区域，其生态环境在剧烈人为干扰下遭受严重破坏。随着经济转型和新能源运用，矿业城市逐渐衰落，旧矿区普遍面临生态环境治理与产业转型的双重问题。本溪市是一座地理环境优美、资源蕴藏丰富的山城，是全国重要原材料工业基地1，是国内重要的铁矿产地之一，具有数十年的开采历史，形成了多个规模较大的露天采矿场。在露天开采过程中，需要剥离覆盖于矿床上部及其周围的表土和岩石，然后将其排弃在专设的场地，这种场地即是排土场，又称为废石场。露天铁矿排土场破坏了以植被为核心的

11、生态系统，带来严重的生态问题，这些生态问题直接影响甚至威胁本溪市的城市生态环境，并对当地的百姓生活带来严重危害。因此，加快对这些矿山进行生态恢复和生态重建显得更加迫切。尾矿库的堆放不仅占用了大量的土地，而且堆积起来的尾矿库高过附近居民房屋好几倍。铁尾矿是由铁矿石直接粉碎而成，质地较粗，保水性差，表面覆盖的细颗粒物质如土、沙等不仅会大量流失，而且还可能带来泥石流、滑坡等地质灾害，影响着附近居民的正常生活，使当地的居民面临着矿山开采所带来的一些威胁2。对矿山废弃地的治理已经非常必要了。矿区生态环境的恢复不但可以解决面临的环境恶化所带来的危害，而且还有可能为当地的经济发展起到推动的作用。1.1矿业废

12、弃地对环境的影响采矿地是剧烈人为干扰下的一种特殊景观类型，是人类为获得矿产资源而对土地进行剧烈改造的区域3。采矿地景观因采矿活动而发生前后的剧烈变化。采矿之前，当地生态系统处于相对稳定状态，系统内自我组织、自我调整状态良好，而开采后景观的稳定性被破坏，对周边生态环境也造成诸多损害。1.1.1破坏生态平衡采矿作业时对土地扰动巨大，采伐树木、机器轰鸣和爆破等因素对周边环境造成极大影响，另外，矿产加工过程产生的排弃物也侵蚀着自然环境，且多含有有害物质，影响更为恶劣。矿区将会在很大程度上影响区域内原有生态系统的完整性。大多矿区自然体系的核心是生物，尤其是植被。以植被为核心的生态系统，将由于植被破坏而发

13、生根本性的变化，主要表现在：（1）矿区开采造成直接施工区域内地表植被的完全破坏和施工区域一定范围内植被不同程度的破坏。（2）施工运输、施工机械、人员践踏、临时占地、废石堆放破坏一定区域内的植被。（3）矿区产生的粉尘以及运输车辆行驶激起的尘土等，将使周边的林草地受到危害。（4）矿区开采引发的地表塌陷、挖损对生态系统的影响则是长期的，伴随于开采整个生产期间，并且在矿区废弃后都就将长期影响着生物的再生长，因此矿区开采对自然生态体系产生的影响是不可估量的。（5）矿物排放的废弃物大多含有不同成分、含量的化学物质，它们经淋溶、扩散、氧化等一系列的化学反应后产生一些危害物质，通过改变土壤的PH值，破坏原有土

14、壤的生态系统，使得微生物环境被破坏，产生不利于植物生长和重建的因子，有些甚至可形成严重污染，危害人和动物的健康。所有这些都严重破坏矿区动植物和微生物的生存环境。生物数量和种类减少，生态平衡遭到严重破坏是矿区普遍面临的现状。1.1.2破坏地表景观矿区环境景观是人们身处矿区时对周边环境的总体视觉印象。采矿作业无论是地下开采还是露天开采，都需要剥离表土，砍伐周边树木及植物，势必对生态环境造成破坏，形成植被清除、地表裸露，并被挖陷的情况。长此以往，地表景观就形成荒芜、贫痔的大片裸地景观，且常常造成地面沉陷及裂缝等质地灾害，土层剥离、土壤流失，植物难以生长。1.1.3有害物质扩散采矿活动产生的有害物质是

15、多种多样的。产生的粉尘污染大气环境，引发区域性的严重问题，极大影响周边居民的健康;洗矿过程产生的大量废水大多含有重金属元素或是酸碱度较高，如不妥善处理，将严重污染环境。矿业排弃物也通常具有很高的重金属含量，经露天堆放及风化后，重金属元素会随着降雨等作用扩散到周边区域，引发灾害。1.1.4侵占土地资源我国共有大中型矿山9000多座，小型矿山2.6105座，因采矿侵占的土地面积已接近4.0104km2，每年由此而废弃的土地面积达330 km24。中国现有矿山堆放的尾矿占用大量土地，其中相当一部分是良田沃野，仅1957-1990年，中国因矿山占地损失的耕地占全国总耕地损失的49%5。矿山开采破坏森林

16、面积达1.06106 hm2，中国现有森林面积 1.34108 hm2，破坏率达13.9%。破坏草地面积达到2.63105 hm2，且引起大范围的土地退化，退化率为37%，且每年以6.7104 hm2的速度递增6。所有这些数据足以说明因采矿而造成的土地资源流失数量是巨大的。1.1.5地质灾害频发采矿作业严重破坏生态系统稳定性，地表塌陷及山体滑坡等现象在矿区时有发生。遇到暴雨天气甚至引发泥石流灾害。不断的开采作业也造成地下水位下降，整体地表水与地下水系统的均衡也被打破。究其原因，地下采空区域面积过大、矿坑积水严重和大量堆放排弃物等都是引发地质灾害的重要因素。1.2土壤中微生物的作用土壤生态系统是

17、一个具有生物多样性的及其复杂的体系，土壤生态系统的主要功能主要是主要是由微生物的机制所控制的，土壤微生物机制控制土壤微生物群落的形成，土壤微生物群落中主要包括细菌、真菌、放线菌等。1.2.1土壤微生物参与物质循环微生物在生态系统中的最大价值在于其分解功能。绝大多数微生物作为异养生物，它们分解着生物圈内存在的动物、植物和微生物的残体以及各种复杂有机物质，吸收某些分解产物，最终将有机物分解成简单的无机物，如CO2、H2O、NH3、SO2-4和PO3-4这些无机物又可以被初级生产者利用，再次参与物质循环。尤其是一些特殊物质，如腐殖质、蜡和许多合成化学物质，只有微生物才能分解。尽管所有生物都参与生物地

18、球化学循环，但微生物在有机物的矿化中起决定性作用，地球上90%以上有机物的矿化均是由细菌和真菌完成的7。土壤微生物也是土壤生态系统中库和流的一个巨大的原动力，尤其在养分缺乏的生态系统中土壤微生物既是养分源又是养分库8,可以说土壤微生物库可用作植物养分动力学研究的有力指标。1.2.2土壤微生物改善土壤结构土壤微生物通过分泌土壤酶，提高土壤肥力。研究表明9，土壤肥力水平在很大程度上受制于土壤酶的影响，与土壤酶活性之间存在着非常密切的相关关系。土壤微生物还通过自身的生理活动，参与、促进疏松多孔的土壤结构的形成。其中土壤微生物通过分解有机质和辅助形成大分子物质，来参与土壤结构的改善，一是表现为分解碳水

19、化合物，释放出盼等腐殖质的合成原材料，参与腐殖质的合成。腐殖酸盐含有大量功能团，既能改良土壤10,又能刺激作物生长11。二是土壤微生物在消耗植物基础物质进行自身细胞合成和微生物自溶过程中出现大分子物质，如作为细菌副产物或储藏物质的大量多糖，特别是被吸附于土壤胶体上具有幾基的多糖，均具有结合粘土矿物颗粒的能力。由此可见，细菌、放线菌、真菌的细胞物质及分泌物都是影响团粒形成及其稳定性的因素12。土壤结构的改善可以改进土壤通气状况、水分渗透能力，进而可以促进植物生长。1.2.3土壤微生物促进植物生长土壤微生物生物量既是土壤有机质和养分转化与循环的动力，又可作为土壤中植物有效养分的储备库。植物根际促生

20、细菌可以分泌生长调节物质、抗生素类物质促进植物的生长。微生物体产生的聚合物具有抗干旱、降低水分胁迫、改善土壤结构、供应植物有机营养和调节离子活性的能力。1.2.3.1 微生物与植物氮素营养土壤中氮的形态以有机氮为主，有效性的矿质态氮的数量在很大程度上依赖于土壤有机态氮的矿化，有机态氮的矿化与土壤微生物活性大小有关。土壤中无机氮主要有铵态氮和硝态氮两种形态，由于铵态氮很容易发生硝化作用，因而土壤中的硝态氮的含量要比铵态氮大得多。铵态氮在土壤中己被吸附固定、移动性小；硝态氮在土壤中的移动性较强，可以通过质流被植物吸收，而铵态氮移动性差，主要靠扩散被植物吸收。许多研究表明，丛枝菌根真菌对自然界中的氮

21、循环起着重要的作用：一方面丛枝菌根真菌通过改善植物的磷营养状况提高根瘤菌的固氮活性，促进豆科植物生长，增加固氮量；另一方面丛枝菌根真菌加速土壤有机氮矿化，增加有效氮的数量；此外，菌根可以通过增加吸收面积和与土壤的接触位点增强对氮的吸收作用。关于菌根菌丝直接吸收土壤氮素的作用，R. N. Ames13等人早在1983年就通过15N标记试验证明，丛枝菌根菌丝能够从根外数厘米远的土壤中吸收NH4+，并运输到宿主植物根中。并且丛枝菌根真菌能增加植物从有机氮源中吸收钱态氮。由于土壤中氮素的移动性比磷钾等养分大得多，可以从较远的地方通过质流和扩散迁移到植物的根表，为根系直接吸收利用，加之菌根菌丝吸收氮素的

22、能力相当于植物的需要量而言，往往是微不足道的。1.2.3.2 微生物与植物磷素营养缺乏磷素一直是植物生长的主要因素，因此微生物对植物磷营养的作用一直是人们关注的焦点。Gerretsen14首次发现对植物接种根际微生物可以促进植物生长和磷元素吸收的效应。随之，很多学者为了促进植物生长和改善植物磷营养的状况，对其利用根际微生物来溶解难溶性磷，从而改善土壤中的磷营养，这种方法得到了广泛的开展，而土壤中凡是对难溶性磷具有溶解性能力的微生物均被称为解磷微生物。解磷微生物种类繁多，大多数解磷微生物主要分布于植物的根际，主要包括细菌、真菌和放线菌。植物根际土壤中的解磷细菌主要是假单抱杆菌和芽抱杆菌。在土壤中

23、的解磷真菌数量较细菌少，但是有研究认为解磷真菌在溶解难溶性磷源的作用方面可能比解磷细菌要强的多，而土壤真菌中具有解磷能力主要为Penicilluim和Aspergillus属真菌。微生物对复垦土壤养分的活化及吸收具有一定的促进作用。微生物在生长繁殖过程中常常会产生一些代谢产物，并分泌到体外，促进土壤难溶性磷的转化，影响植物的生长发育。解磷微生物的分泌物中可能包括有机酸、铁载体、H+、氨基酸、植物生长调节物质、维生素或各种胞外酶。解磷微生物的种类不同，其分泌物的组成和数量也不相同，并且对植物生长和难溶性磷转化的影响机制也有所不同。许多解磷细菌可以和青霉、曲霉、镰袍霉等可通过分泌多元有机酸来促进土

24、壤难溶性无机磷酸盐的溶解，同时改善植物对磷的吸收和利用。解磷微生物所释放的一些有机酸可能引起根际土壤pH值降低，从而使得土壤中的难溶性无机磷得到了进一步的溶解，同时某些有机酸能与土壤中的Al-P、Ca-P和Fe-P型的无机磷酸盐发生鳌合作用，从而促进土壤中的无机态难溶性磷的释放。1.2.3.3 微生物与植物钾素营养在土壤风化程度高、固氮能力强、土壤干旱缺水造成钾的有效性较低及施肥比例长期严重失调的条件下，作物往往出现缺钾的现象。微生物能促进作物对钾的吸收和利用。在一些实验中，接种菌根菌提高了植物体内钾浓度，在提高植物吸磷的同时也提高了植物吸钾量。菌根侵染植物后，改善了宿主植物的磷营养，促进根系

25、的生长，增加根系吸收土壤养分的活性，延长根系吸收养分的时间，以及由于生物量的增加而导致对钾吸收的间接作用都可能促进植物对钾的吸收总量或提高植物钾的浓度。菌根侵染提高植物钾浓度或吸钾总量的另一种可能机理是菌丝的直接吸收和运输作用。钾在土壤中的移动性虽比磷强得多，但在一般生长条件下，由于植物吸收钾的速率大于钾在土壤中的移动速率，因而往往在根际内仍能很快形成一个钾浓度亏缺区，从而限制根系对钾的吸收。土壤供钾水平不能满足植物生长的需要时，菌丝伸展到钾亏缺区以外，吸收根系吸收不到的钾，并运输给植物，对改善植物的钾营养将有一定作用。1.3微生物在土壤环境修复中的作用1.3.1污染物的微生物降解及转化微生物

26、对环境污染物具有巨大的降解、转化潜力。环境中存在的各种天然物质，几乎全部可以找到使之降解、转化的微生物。一般认为，由于微生物个体微小、种类繁多、繁殖迅速、代谢类型多样、易变异且适应性强等特点，新的化合物进入环境时，微生物能通过突变形成新的变种，或通过诱导合成新的酶系来适应这些物质。并且，微生物之间还能通过对污染物的共代谢作用或传递降解性质粒，加速对环境污染物的降解和转化。微生物可以降解有机污染物，如石油等芳香族和脂肪族碳氢化合物以及农药。能降解石油的微生物种类有很多，已报道的有70多个属200多种，其中细菌28个属，如节杆菌属和假单胞菌属，酵母菌12个属，真菌是石油的主要分解者。在降解石油烃的

27、微生物群落之间存在这演替和协同作用。通常，降解首先由细菌开始，主要是利用烷烃和选择性地利用环烷烃。其后，酵母和霉菌群落的作用占优势，它们降解环烃和芳烃。石油污染区的微生物群落往往与原来的微生物群落不同。因此，微生物群落特征不仅可以反映环境受烃污染的程度，还可用来指示石油矿藏、勘探石油资源。农药由于不断地想环境中释放，在为人类造福的同时也造成了及其严重的污染。在降解农药的微生物中，细菌主要有假单胞菌属芽孢杆菌属、气杆菌属等，放线菌以诺卡菌属等为代表，霉菌以曲霉属、木霉属等为代表。微生物也可以对环境无机污染物如重金属污染进行转化。有色金属矿业废弃地常常会含有大量的重金属，经过风化后会通过降水、风扬

28、等作用向周边地区扩散。由于其很难被降解而在生物体内富集，最终严重地危害生态系统的功能和人畜健康。利用微生物的吸附积累作用来减轻重金属的污染效应已倍受关注。如枯草芽孢杆菌的细胞壁可结合大量的重金属，从而降低植物对重金属离子的吸收。活性污泥中的多种细菌产生的胞外聚合糖对镉、镍、铜等有很强的亲和力，通过絮凝物的沉淀将其从废水中除去15。 常慧萍16从中原油田污染土壤中通过实验室驯化培养分离到一组能以中原原有为碳源的快速生长的石油烃降解菌，并通过试验证明，该降解菌是一组高效降解菌且其与植物联合修复石油污染土壤能显著提高修复效果。1.3.2微生物的生物修复生物修复是指在一定的条件下，利用微生物、植物和动

29、物降解、稳定和去除环境中的污染物，使受污染生态系统的正常功能得以恢复。利用生物修复技术可以削弱乃至消除环境污染物的毒性，降低污染物的健康风险17。同物理化学方法(包括化学淋洗、填埋、客土改良、焚烧饿电磁分解等)相比，生物修复技术具有成本低、不产生二次污染，由于生态协调而易于被公众接受等优点。微生物在生物修复中起着主导作用，早期的生物修复主要是利用微生物降解和转化环境中的有机污染物质18。利用植物和微生物共同作用进行修复称为植物微生物联合修复技术。植物根部为微生物提供良好的生长环境，根的分泌物和脱落物对根际微生物的生长具有促进作用，从而加快污染物的生物降解过程。有研究发现，人为地在土壤中添加氰化

30、物，使得植物的种子难以萌发，而对种子进行真菌的处理后就可以正常萌发，且生长速度与为用氰化物处理的植株生长速度接近。这说明在该体系中，植物与真菌构成了联合修复系统，完成了氰化物的解毒过程19。陆引罡等20，以黄壤作为供试土壤，种植重金属富集植物与非富集植物，采用室内培养方法对外加镍污染黄壤的微生物活性及其群落结构进行了研究。结果显示，镍严重污染破坏了土壤微生物区系，使土壤细菌、放线菌及真菌数量下降，其中放线菌对重金属毒性影响最为敏感，重金属富集植物车前草引起土壤微生物区系的变化较小，表现了良好的修复能力。1.4国内外土壤微生物研究现状1.4.1国内土壤微生物研究现状由于需要复垦的土壤是需要重新构

31、建的土壤结构的，其生态环境不可避免受到破坏，存在许多不利于植物生物生活的土壤条件，如吸收太阳辐射能量过多，导致地温较高，不利于出苗，且昼夜温差大，对植物生长不利等。复垦土壤中的旱涝、盐渍及病虫害问题，也是复垦工作需要解决的，李晓林等21采用根室培养方法研究证明：在养分胁迫条件下 VA 菌根真菌约可向植物提供生长所需的80%的磷、50%的锌和铜，植物生长良好。因此，微生物的存在无疑增强了植物对其逆境的抵抗能力。丛枝菌根真菌的菌丝对水分的吸收利用是十分显著的，接种菌根真菌能够提高植物对干旱胁迫的抵抗能力。林先贵等22研究了VA 真菌对植物抗旱涝能力的影响，指出菌根的早期形成对提高植株整个生育期的抗

32、逆性有重要的作用，干旱胁迫对菌根真菌的侵染和菌丝的发育影响不大，菌根明显增加了植物的抗旱能力。鹿金颖23在盆栽条件下，研究了AM 真菌对酸枣实生苗生长和抗旱性的影响。结果表明，在土壤相对含水量为20%、40%、60%条件下，AM 真菌能显著增加酸枣实生苗的生长量，降低叶片自然饱和亏和脯氨酸含量，提高植株叶片气孔导度、蒸腾速率、光合速率，显著增强了植株的抗旱能力。在土壤相对含水量相同的状况下，接种菌根真菌的植株制造1g干物质的需水量低于不接种的处理，节水效果为 16.5%29.8%。植物与 AM 真菌的共生关系表现在菌根真菌依赖寄主植物的光合产物维持自身生长和繁殖，并帮助植物吸收更多的矿质养分和水分24，促进植物在胁迫条件下生长。虽然 AM 真菌在一定程度