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1、整理细胞生物学实验讲义植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面

2、的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。三、实验用品1、材料半夏无菌苗。2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径911cm)。5、药品与试剂1).药品(见下表)2).70酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。(各类成分浓度、用量详见下表)。表1 MS培养基母液配制 (单位：mg)类别成分规定量称取量母

3、液体积(ml)扩大倍数配1升培养基的吸取量(ml)大量元素KNO3190019000100010100NH4NO3165016500MgSO47H2O3703700KH2PO41701700CaCl22H2O4404400微量元素MgSO44H2O22.302230100010010ZnSO47H2O8.6860H3BO36.2620KI0.8383Na2MoO42H2O0.2525CuSO45H2O0.0252.5CoCl26H2O0.0252.5铁盐Na2-EDTA37.253725100010010FeSO47H2O27.852785有机物质甘氨酸2.010050010010盐酸硫胺素0

4、.420盐酸吡哆素0.525烟酸0.525肌醇10050001).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(6080)蒸馏水中。一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO47H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。4).有机物质母液(100倍液)分别称取50倍用量的各种有机物质，

5、依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。除了上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。5).生长素如2，4D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml 95乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。6).细胞分裂素如激动素(Kt)、6-卞基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。2、 1L培养基的配制与分装1).取1000ml烧杯一只，加大量元

6、素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml，有机物质100倍母液10ml。然后加水至800ml，加蔗糖30g，NAA终浓度0.25mg/L,6-BA0.75mg/L。待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8-6.0。2).取一个250mL的烧杯，加200mL蒸馏水。煮沸后加8g琼脂条，待煮到一定境界后，液体为白色，糊了就会有点偏黄，但液体中最好不要还可见条状的琼脂。煮琼脂时顺便把刚才的800mL液体也加热至50-60度，待琼脂煮好后再混合就能避免琼脂凝固。分装到培养用三角瓶中，每只50ml三角瓶约装20-30ml培养基。分装时要避

7、免把培养基倒在瓶口上，如果这样做了就用滤纸擦一擦，否则培养时容易引起杂菌污染。3).把牛皮纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起来，使成正方形，紧密裹在瓶口上，随后便可进行灭菌。培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类、外植体的来源以及具体的实验目的和要求来确定的。培养基中附加的蔗糖浓度均为0.8(m/v)。3、培养基的灭菌把装好培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，我们此次用的是卧式灭菌锅，用法比较特别。首先最重要的是要确保水加够，然后放气阀为确保安全是一直开着的，先将旋钮打在关闭上，打开电源，当第一次加热的显示灯灭了之后，转换旋钮至灭菌，当第二次加热灯灭的时候，开始计时20min，然后关闭

8、电源，打到慢排至压力降到0.05MPa再打到快排，降到0.02MPa后再换成全排，降至零后再换成关闭，打开盖子透气，让纸慢慢变干。放气过程有声音，所以也可以通过声音来判断是否该转换。3、 超净台的操作两小时前先用70%酒精擦拭超净台，擦好后关上挡风玻璃，按D打开紫外，接种前15分钟，关闭紫外，打开大风，稍微将挡风玻璃打开一点。 先在外面把手洗干净，然后在超净台内先用70酒精浸泡过的棉球擦拭工作台的台面。放入培养瓶和接种工具，接种用的镊子、解剖刀、接种针及培养皿等可事前放入，点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭手。把镊子、解剖刀、接种针灯插入盛70酒精的广口瓶中。取一瓶半夏的无菌苗，先将整瓶苗分装到各个培

9、养皿内的吸水纸上以防交叉感染，吸干水后，把叶子切成35mm大的小片，打开三角瓶，把叶片投入瓶内，用接种针拨匀，重新盖上牛皮纸，扎上棉线。用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号，标明接种日期。全部接种工作都是在严格无菌条件下进行的，所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。五、培养和观察接种完毕后取出培养瓶，置2628恒温培养箱室内，先暗处理三天再移置在光照条件下培养，定期进行观察。一般三天染细菌（长菌处有浑浊的液体），七天染真菌（长菌处有霉和普通的霉差不多）如有污染则弃之，培养34周后观察实验结果。五、实验结果1、计算接种成功率(指没被污染的叶片数占总叶片的百分比)和诱导成功率(指诱导出细胞的叶片

10、数占总叶片的百分比)。如果没有添加植物激素结果又会怎样？为什么？2、人工条件下培养的植物离体器官、组织或细胞，经过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整植株的过程说明什么问题？细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求 1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。二、实验原理 核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而

11、派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。三、器材与试剂 1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。2、材料：鸡血。3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿派洛宁混合染液。4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。再称取醋酸钠（NaAC3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即

12、成。甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40C温箱中干燥后备用。（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。该液应现配现用，不宜久置。四、内容与方法 1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血

13、涂片，室温下晾干。2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。 4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。五、作业与思考 1、简述DNA和RNA的染色原理。2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？鸡血细胞体外融合一、实验目的（1） 了解聚乙二醇诱导体外细胞融合的基本原理。（2） 通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。（3）

14、 二、实验原理细胞融合又称体外细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体细胞同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组和在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：1.病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒；2.化学因子诱导的细胞融合，如PEG；3.电场诱导的细胞融合；4.激光诱导的细胞融合。PEG是乙二醇的多聚合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。该方法应用相对

15、分子质量为400-6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。三、实验仪器、材料和试剂（1） 仪器、用具：注射器、离心管、离心机、水浴锅、滴管、显微镜烧杯、容量瓶、载玻片、盖玻片、酒精灯等。（2） 材料：鸡血细胞。（3） 试剂：1）0.85%NaCl溶液2）GKN液：8.0gNaCl, 0.4g KCl, 1.77g Na2 HPO42H2O, 0.69g NaH2PO4H2O, 2.0g 葡萄糖，0.01g 酚红，溶于1L蒸馏水中。3）50%（m/v）PEG溶液：取50g PEG4000

16、水浴融化后冷却至5060加50m预热至5060的GKN液， 混匀，至于37备用。4）Hanks 原液（10）：80.0g NaCl, 1.2g Na2 HPO42H2O, 4.0g KCl , 0.6g KH2PO4 , 2.0g MgSO47H2O, 10.0g 葡糖糖，1.4g CaCl2称取1.4g CaCl2，溶于3050mL蒸馏水中。取1L的烧杯及容量瓶各一个，先在烧杯中放入800mL蒸馏水，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解之后，方可加入下一药品，直到葡糖糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1L。5）Hanks液： Hanks 原液 100

17、mL 蒸馏水 896mL 0.5%酚红 4mL配好的hanks液保存于4度冰箱。四、方法与步骤1.制作鸡血细胞储备液取来鸡血后，按照100U肝素/5mL全血的比例制成抗凝全血，然后再在其中加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制成红细胞储液，置于4冰箱内可供一周使用。2.细胞悬液的制备取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL0.85%NaCl 溶液，混匀后，1200r/min离心5min，弃去上清液，再加入5mL0.85%NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入3mL的GKN溶液制成鸡血细胞悬液。3.鸡血细胞的收集吸取1mL鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mL Hanks液混匀，100

18、0r/min离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。4.PEG诱导细胞融合（KEY）吸取1mL 37度的50%PEG溶液，沿着管壁迅速加入然后立即轻轻摇匀（此步非常容易造成血液凝集，不要拿离水浴锅太长时间）。37度水浴两到两分半钟。5.终止PEG作用缓慢加入5mL Hanks液，轻轻吹打混匀，置于37度水浴锅中静置5min。6.制备细胞悬液 用吸管轻轻吹打细胞团块分散（KEY），1000r/min离心5min,使细胞完全沉降。弃去上清液，加800mLHanks，混匀。7.镜检 在载玻片上滴一小滴细胞悬液，盖上盖玻片，先在10倍镜下找到细胞，再在40倍镜下看，如看

19、到有疑似融合的，先调焦做第一次确定，如若确定通过，再用100倍镜确定（另外，视野较暗会比较容易观察）。Feulgen反应一、实验目的学习Feulgen反应的原理与操作步骤。二、实验原理Feulgen反应是由Feulgen和Rossenbeck 于1924年创立，是特异性显示DNA的最经典方法。它主要包括DNA水解和显色两个反应步骤。DNA在60条件下经稀酸（1mol/L HCL）水解，分子中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂反应，形成紫红色的化合物，因此，细胞内含有DNA的部位会呈现紫红色阳性反应。福尔根反应即可进行DNA定位显

20、示，又可用显微分光光度计惊醒定量分析。Feulgen反应对组织中的DNA高度专一，组织中除DNA外还有多糖、RNA和其他自由醛基，固定液也可能产生一些醛基。但是，自由的醛基可能被盐酸酸解消除，绝大多数RNA经1M盐酸在60温度下处理会降解为可溶性成分，而多糖在此反应条件下则不会产生裸露的醛醛基。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。三、实验用品1、材料：洋葱根尖2、器材：解剖刀、镊子、水浴锅、载玻片、盖玻片、（1）环境的使用价值。环境的使用价值（UV）又称有用性价值，是指环境资源被生产者或消费者使用时，满足人们某种需要或偏好

21、所表现出的价值，又分为直接使用价值、间接使用价值和选择价值。3、药品与试剂:B.可能造成重大环境影响的建设项目，应当编制环境影响报告书1mol/L盐酸：取82.5ml密度1.19g/ml浓盐酸加蒸馏水至1000ml。Schiff试剂：称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角瓶），时时震荡，继续煮5min（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却至25时，加入0.5gNa2S2O5充分震荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处理静止至少24h（有时需23d），使其颜色褪至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力震荡1min，然后用粗滤纸过

22、滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能在使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾，使之再转为无色，仍可使用。亚硫酸水：200ml自来水、10ml 10偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾溶液、10ml 1mol/L HCl，使用前，三者混匀使用。（三）环境价值的定义四、实验步骤（2）规划编制机关在报送审批专项规划草案时，将环境影响报告书一并附送。1、将洋葱根尖放在1mol/L HCl中，在60水浴锅中保温810min。2、蒸馏水水洗。既包括天然的自然环境，也包括人工改造后的自然环境。3、Schiff 试剂遮光染色30min。4、用新鲜

23、配制的亚硫酸水溶液洗涤3次，每次1min。5、水洗5min。6、将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片。1.环境总经济价值的构成7、镜检，细胞中凡是有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。8、找出根尖正在分裂的细胞，并找出它的前、中、后、末、间等五个时期。对照组：先将材料放在5%三氯醋酸中90水浴15min，其他步骤同实验组。1.建设项目环境影响评价文件的报批（1）环境的使用价值。环境的使用价值（UV）又称有用性价值，是指环境资源被生产者或消费者使用时，满足人们某种需要或偏好所表现出的价值，又分为直接使用价值、间接使用价值和选择价值。 细胞凝集反应一、实验目的在可行性研究时应进行安全预评

24、价的建设项目有：了解细胞膜的结构与功能。（2）列出有关的法律、法规、规章、标准、规范和评价对象被批准设立的相关文件及其他有关参考资料等安全预评价的依据。二、实验原理细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。凝集素(lectin)是一类含糖(少数例外)的并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。三、实验用品1、 土豆块茎2、 显微镜、粗

25、天平、载玻片、滴管2支、离心管2支。3、 PBS缓冲液NaCl 7.2gNa2HPO4 1.48gKH2PO4 0.43gH2O 1000ml4、 2的红细胞四、实验步骤1、2的红细胞的制备：取一定量的红细胞，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2红细胞液。2、称取去皮土豆块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸提液中含有可溶性淀粉土豆凝集素。3、用滴管吸取土豆凝集素和2红细胞液各一滴，置于载玻片上，充分混匀，静置20min后，于倒置显微镜下观察血球凝集现象。4、以PBS液加2血细胞液作对照实验。五、实验报告：简图表示血细胞凝集原理。

26、细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以水分进入细胞，引起溶血，溶质渗入速度不同，因此溶血时间也不同。三、实验材料和试剂1、 器材50ml小烧杯，10ml移液管，试管，试管架。2、材料：动物血液3、试剂： 0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.32mol/L硝酸铵、0.17mol/L硝酸钠 0.12mol/L草酸铵和0.12mol/L硫酸钠0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol

27、/L乙醇和0.32mol/L丙酮四、实验方法1、动物血液的稀释：取1份血液，加入10份0.17mol/L氯化钠溶液即可。2、低渗溶液：取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释的血液，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。3、红细胞的渗透性：取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的血液，并轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？取试管一支，加入0.17mol/L氯化铵溶液10ml，再加入1ml稀释的血液，并轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记下时间(自加

28、入稀释血液到溶液变成红色透明澄清所需时间)。分别在另外几种溶液中进行同样的实验。步骤同上。五、实验结果讨论与分析将观察倒的现象列入下表，对实验结果进行比较和分析。试管编号是否溶血时间结果分析1.10mlNaCl1ml稀释血液2. 10mlNH4Cl1ml稀释血液3. 10mlNH4Ac1ml稀释血液4. 10mlNaNO31ml稀释血液5. 10ml草酸铵1ml稀释血液6. 10mlNa2SO41ml稀释血液7. 10ml葡萄糖1ml稀释血液8. 10ml甘油1ml稀释血液9. 10ml乙醇1ml稀释血液10. 10ml丙酮1ml稀释血液人外周血细胞培养及染色体制备 微量全血培养1966年以前

29、基本上用Moorhead等1960年建立的人体外周血白细胞培养技术，它的优点是方法比较完善。缺点是取血量较多，手续较麻烦。近三十年来国内外绝大多数均采用微量全血培养技术，不但取血量少，而且可略去一些操作过程，如离心、分离血浆等，计数时，既方便，也节省人力与物力，便于推广应用。一、实验目的在体外培养外周血淋巴细胞，制备人的染色体二、实验原理在活体情况下，进入外周血的小淋巴细胞不能进行增殖，存活一定时间后就死去，由新进入外周血的小淋巴细胞补充。但在人工离体培养条件下，培养基中的PHA（phytohemagglutinin,植物血细胞凝集素）有刺激小淋巴细胞转化并进行分裂的能力。此时如加入适量秋水仙

30、素（或秋水酰胺），便可使许多分裂细胞停滞于中期。采用常规制片技术，即可得到大量含染色体的标本。三、实验用品材料 人静脉血 器材 超净工作台、恒温箱、离心机、显微镜、移液管（5ml）、链霉素瓶（或25ml组织培养方瓶）、血浆瓶（100ml）、注射器（1ml、2ml）、烧杯（100ml）、量筒（50ml）、剪刀、镊子、酒精灯、精密PH试纸试剂RPMI-1640液（或Eagles液），小牛血清、肝素、PHA、双抗（青、链霉素）、5%NaHCO3、2%碘酒、75%酒精、2ug/ml秋水仙素（或2ug/ml秋水酰胺）、淋巴细胞培养基组成，包括人工合成培养液、血清、PHA、肝素、抗菌素等。人工合成培养液有很多种，一般常用的有TC-199、McCoy5A、Ham F-10、Ham F-12、RPMI-1640等，PHA（,植物血细胞凝集素）是从豆子（四季豆、雪山大豆、鸡子豆等）经0.85%生理盐水浸渍后提取的一种糖蛋白。 四、实验方法培养基的制备将无菌室紫外线灯开放12小时，洗和刷手，穿上无菌衣，拖鞋进入无菌室，开启超净工作台，关闭超净工作台的紫外线灯。用75%酒精擦洗手和各种试剂