女性上生殖道微生物群特征及其对生殖与辅助生殖的影响.docx

1、女性上生殖道微生物群特征及其对生殖与辅助生殖的影响2020年女性上生殖道微生物群特征及其对生殖与辅助生殖的影响人体微生物群是指存在于人体内部和表面的微生物的总体。据估计，人体内部和表面的细菌数量与构成人体的总细胞数具有相同的数量级1-2。随着人类基因组计划（ Human Genome Project，HGP） 的完成，“第二个人类基因组计划”这一概念又被提出，2007年美国国立卫生研究院（NIH）发起了人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP），对正常健康志愿者身体不同部位的微生物组进行特征分析，其中就包括女性阴道3。过去10年中，针对人体不同器官微生物群的研

2、究成为热点，人们对于微生物群在人类健康中作用的认知也不断加深，微生物群失调或失衡与疾病的发生有关。越来越多的证据表明，女性生殖道微生物群改变可能影响生殖健康。既往较多研究集中在阴道微生物群对生殖的影响4-5，而对定植于宫腔、输卵管、卵巢等部位的微生物组成的女性上生殖道微生物群研究较少。近年来随着技术的进步，尤其是基于测序的细菌检测方法的应用，有关上生殖道微生物群的文献逐渐增加。本文对上生殖道微生物群的研究现状进行综述，阐述上生殖道微生物群常用研究方法、上生殖道微生物群的特征及其对生殖和辅助生殖的影响。1 上生殖道微生物群研究方法基于目前已发表的文献，用于微生物群研究的主要技术有2种，即培养法和

3、非培养法，亦即基于培养的技术和基于测序的技术。1.1 基于培养的技术 早期对于生殖道微生物群的研究多数采用基于培养的技术。将标本接种在不同培养基上，生长一段时间后根据革兰染色特征、细胞形态、细菌代谢产物及生化反应试验等对细菌进行鉴别。但研究发现，由于培养条件不满足或一部分菌种对另一部分的抑制，大多数微生物生态系统中只有一小部分细菌能在实验室中繁殖，而培养成功是后续研究分析的先决条件，因此基于培养的技术会大大降低所研究微生物群的多样性6-7。虽然基于培养的技术在微生物群研究方面仍不失为一种基础而有效的手段，但对于其所得数据的阐述和分析需考虑到这种局限性。1.2 基于测序的技术 第一个细菌基因组测

4、序在1995年完成8，此后细菌脱氧核糖核酸（DNA）数据库迅速发展，如今的技术可以对一个样本中的数百万种细菌DNA序列进行分析。细菌DNA测序技术克服了培养法的不足，传统上难以培养或不可能培养的细菌因此得以检测，为微生物群的研究带来突破，其中16S rRNA基因测序是近年应用最广泛的技术。16S rRNA是原核生物核糖体30S小亚基的组成部分，其对应的DNA序列即为16S rRNA基因，长度约1540 bp，为原核生物所特有，存在于所有细菌和古细菌的基因组中。16S rRNA基因测序技术的理论基础在于其包含10个保守区和9个高变区（V1V9），两者呈交替排列，保守区为进化较慢的区域，可用于设计

5、通用引物，而高变区为进化较快区域，其变异程度与细菌的系统发育密切相关，通过对一个或多个高变区扩增测序，可以在“属”甚至“种”的水平对细菌进行鉴定9。微生物组研究的主要流程包括样品收集和储存、DNA提取和纯化、目标片段聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序、数据清理以及分析等10。与阴道微生物群取样相比，上生殖道取样过程更复杂，且通常为有创操作。子宫内膜微生物群取样途径主要有3种，即经子宫颈取样、腹腔镜或开腹手术中通过子宫微小切口或经子宫底穿刺针吸取样11以及从子宫切除标本中对子宫内膜直接取样12，其中经子宫颈取样适用人群最广泛，但需尽量避免来自阴道或子宫颈的污染。常用的方法有：人工授精（IUI）导

6、管吸取子宫内膜液13、子宫内膜拭子14、通过特殊的子宫内膜取样器取样（如Tao Brush，在取样刷进入或退出宫腔的过程中，有保护鞘覆盖以避免宫颈或阴道污染）15或直接利用胚胎移植后导管顶端部分16。有研究比较了腹腔镜或开腹手术中通过子宫微小切口所得子宫内膜样本和经子宫颈所取子宫内膜样本，发现两者的细菌分布具有很高的相似性，由此认为对于非手术患者，经子宫颈取样分析子宫内膜微生物群是可以接受的11。输卵管微生物群取样方法主要有腹腔镜或开腹手术中取样11及输卵管切除术后取样12，也有针对盆腔炎性疾病的研究在输卵管切除术中抽吸输卵管积水或积脓进行微生物群的分析17。卵巢微生物群取样方法主要有附件切除

7、术后取样12和取卵术中抽取卵泡液等18。收集样本后，在进一步处理前，可将样本置于-80冻存。目前，DNA提取主要采用试剂盒，除了取样过程中需小心操作避免阴道宫颈分泌物、血液及其他污染外，作为低生物量样本，上生殖道微生物群样本在DNA提取过程中也会受到来自试剂盒、周围环境的细菌DNA的污染，因此建议在上生殖道微生物群研究中应设置阴性和空白对照组19。16S rRNA基因高变区（V1V9）具有不同程度的序列多样性，在对细菌进行区分时并非每个高变区都具有相同的特异性，因此PCR扩增片段的选择对研究结果有很大影响，目前在人类微生物群研究中较多使用的是V1V2、V3V5和V4高变区20-22。在完成基因

8、扩增及产物纯化后，构建测序文库，进行基因测序，目前测序技术多采用高通量测序，即下一代测序（NGS），常用的测序平台有Roche 454、Illumina Miseq和Ion Torrent PGM。测序完成后进行生物信息统计分析，常用软件有mothur、Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）和Ribosomal Database Project classifier（RDP classifier）等，通常按照97%相似性阈值将所得序列聚类为不同操作分类单元（OTU）23，将OTU代表序列与已有的16S rRNA数据库比对（如Gre

9、engenes，Ribosomal Database Project等），得到每个样本所含的物种信息，继而对各样本及不同组间样本的微生物多样性等进行分析。除16S rRNA基因测序外，宏基因组测序也是目前应用较多的方法。宏基因组测序是对样本中的全部微生物的总DNA进行测序。16S rRNA测序主要研究群落的物种组成及多样性等，而宏基因组测序在此基础上还可对基因功能、参与的代谢途径、微生物之间以及与宿主相互关系等进行分析。2 上生殖道微生物群特征长期以来，人们普遍认为在健康状态下包括宫腔、输卵管、卵巢等在内的女性上生殖道为无菌环境，细菌的存在只与病理状态相关，如阴道细菌上行导致感染和炎症等。随着

10、分子生物学及测序技术的应用，越来越多的研究已证明健康女性的上生殖道中普遍有细菌定植。2.1 子宫内膜微生物群的特征 在现有的大部分研究中，乳杆菌是子宫内膜微生物群的优势菌属。Mitchell等24对58例行子宫切除术女性宫腔微生物群进行研究，用实时荧光定量PCR（qPCR）和广谱16S rRNA基因序列检测12种特定菌种，结果显示其中95%（55例）有至少1种细菌存在或16S PCR阳性，最常见的菌种为惰性乳杆菌、普雷沃菌和卷曲乳杆菌，而子宫内膜炎症标志物在所有样本间无差异。该研究首次通过分子生物学方法证实了宫腔内细菌定植。Franasiak等16将33例行单胚胎移植患者纳入研究，在胚胎移植后

11、留取移植导管顶端5 mm部分作为样本进行16S rRNA测序，共检测出278个不同菌属，持续妊娠组（18例）和未持续妊娠组（15例）微生物群的最主要菌属均为黄杆菌和乳杆菌。Tao等25同样利用胚胎移植导管顶端样本测序对70例体外受精（IVF）患者胚胎移植时子宫内膜微生物群进行研究，结果发现在70个样本中均可检测到乳杆菌属，其中有33例乳杆菌丰度占90%以上，50例乳杆菌丰度占70%以上。此外，在较多样本中检测到的菌属还包括棒杆菌（40/70）、葡萄球菌（38/70）、链球菌（38/70）和双歧杆菌（15/70）。Moreno等26从健康育龄女性中获得子宫内膜液样本，通过16S rRNA测序鉴定

12、出166个OTU，其中最具代表性的为乳杆菌属（71.7%），其次为加德纳菌属（12.6%）、双歧杆菌属（3.7%）、链球菌属（3.2%）和普雷沃菌属（0.866%），子宫内膜微生物群与阴道微生物群的构成不完全相同，证明子宫内膜微生物群存在且不是单纯的阴道微生物群移行的结果。2.2 输卵管微生物群的特征 由于取样困难，目前对于输卵管微生物群的研究相较子宫内膜微生物群的研究少，且更难将健康个体纳入研究。以往对于输卵管内微生物的描述主要局限于对性传播疾病病原体（如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和支原体等）或细菌性阴道病相关病原体的培养，随着基因测序技术的发展，已有研究证明在非炎症状态下输卵管也有细菌定植，并

13、尝试对输卵管微生物群进行描述。Walther-Antonio等27对31例行全子宫双附件切除术患者的阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等微生物群进行研究，其中包括17例子宫内膜癌患者、4例子宫内膜增殖症患者和10例因妇科良性疾病而行手术的患者，结果显示：在输卵管微生物群中，志贺氏菌属和拟杆菌属是最主要的分类群，葡萄球菌、乳杆菌、巴恩斯氏菌和假单胞菌较常见于良性疾病组。Miles等12通过对10例行全子宫双附件切除术女性的阴道、子宫颈、子宫、输卵管和卵巢进行取样研究，发现子宫肌层、子宫内膜和输卵管的微生物群构成与阴道有显著差异；而且与阴道和子宫颈相比，卵巢、子宫内膜、子宫肌层和输卵管的微生物群

14、在其各自的组成上更多样。Chen等11对95例育龄女性的生殖道微生物群进行研究，结果显示从阴道、宫颈到上生殖道，乳杆菌在微生物群中所占比例逐渐下降，在输卵管开口处乳杆菌属相对丰度的中位数降至1.69%；分析显示双侧输卵管微生物群基本相同，输卵管的标志性OTU包括假单胞菌属、丹毒丝菌属和费克蓝姆菌属，腹腔液中的标志性OTU有假单胞菌、摩根菌、鞘氨醇杆菌和漫游球菌，与阴道微生物群以乳杆菌为主不同，子宫颈管和子宫内膜中未发现标志性分类群，说明子宫颈管和子宫内膜可能是阴道与上生殖道微生物群的过渡区；qPCR检测各解剖部位的生物量显示上生殖道微生物群的生物量比阴道内（10101011）低4个数量级。Pe

15、lzer等28为研究输卵管微生物群对生殖健康的影响，对16例行输卵管切除术患者的输卵管微生物群进行分析，结果表明输卵管中细菌丰度较身体的其他部位低，并非所有样本中均有乳杆菌存在，且乳杆菌不是最优势菌属，主要的分类群包括葡萄球菌属、肠球菌属和乳杆菌属，其他丰度较高和典型的分类群还有假单胞菌、伯克霍尔德菌、丙酸杆菌和普雷沃菌；将样本根据不同标准进行分组进一步分析显示，输卵管壶腹部和峡部微生物群组成不同，左侧和右侧输卵管的群落分布也有显著差异，体现了微生物群的部位特异性差异；此外，绝经后女性输卵管较绝经前女性输卵管细菌多样性低，且有无曼月乐宫内节育器输卵管微生物群组成也存在明显差异，说明激素变化可能

16、对定植的输卵管微生物群有影响。2.3 卵巢微生物群的特征 到目前为止对卵巢微生物群的研究尤为稀少，其中较大一部分研究集中在妇科肿瘤领域。Walther-Antonio等27对31例行全子宫双附件切除术的患者行卵巢活检，在良性疾病组卵巢微生物群优势菌属为寡养单胞菌属、黄单胞菌属和乳杆菌属，而拟杆菌属在子宫内膜癌组卵巢样本中占优势。Banerjee等29对卵巢癌微生物群进行研究，选取99例卵巢癌样本，并在其中20例中收集同侧或对侧卵巢非癌组织作为配对对照组，选择另外20例行预防性卵巢切除术患者正常卵巢组织作为未配对对照组，结果显示变形菌门（52%）和厚壁菌门（22%）是卵巢癌组织中的优势菌门，其他比例较低的分类群还包括拟杆菌门、衣原体门、螺旋体门和柔膜菌门等，变形菌门和厚壁菌门也是配对对照组中的优势菌门，而未配对对照组的正