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1、E2E【摘要】 目的 检测结直肠癌组织中E-钙粘素的表达及其淋巴结微转移,探讨两者间的关系。方法 以CK20 mRNA为标记物,应用RT-PCR对60例结直肠癌根治性手术切除的淋巴结标本共782例进行检测;免疫组化法(SP法)检测结直肠癌组织、癌旁组织、淋巴结微转移及正常对照组中E-钙粘素的表达。通过二者的综合分析,试图发现抑癌基因E-钙粘素在结直肠癌淋巴结微转移的生物学行为中的作用。结果 CK20法检出45例(%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为436个(%);常规病理学检出34例(%)患者有淋巴结转移,检出阳性淋巴结数为356个(%);两组比较,差异具有统计学意义(2=,)。11例检出淋

2、巴结微转移患者癌组织中6例(%)E-Cadherin表达阴性,而15例未检出淋巴结微转移癌组织中仅有1例(%)表达阴性,两者比较差异有统计学意义(2=,P=)。结论 E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。【关键词】结直肠癌;E-钙粘素;淋巴结转移;逆转录聚合酶链反应【Abstract】 Objective Purpose To detect the expression of E-cadherin in colorectal carcinoma and lymph node micrometastases,and investigate their82 case

3、s of lymph node simple was dectected with RT-PCR method using CK20 mRNA acridiniumscreening colorectal carcinoma lymph node micrometastases. E-Cadherin expression analysed byimmuno-histochemical staining (the SP method) in colorectal cancer tissue, tissue nearby cancer, the normal control tissue. Re

4、sults In 60 cases of colorectal carcinoma,the expression of E-Cadherin was %.Number of positive nodes was %, the expression of E-cadherin was %(34 cases) and number of positive nodes was %(356 cases) through routine pathological examination. The low level expression of E-Cadherin was positively corr

5、elated with the Dukes staging, serosa infiltration, lymph node and liver metastasis of colorectal carcinoma(2=,).The expression of E-Cadherin was negative in 6 of the 11 patients with lymph node micrometastases,and in %1 of the 15 patients without lymph node micrometastases(2=,P=).Conclusion The neg

6、ative expression of E-Cadherin may contribute to lymph node micrometastases in colorectal carcinoma.【Key words】colorectal carcinoma; E-Cadherin; Lymphatic metastasis; Rt-pcr结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。每年有10%的恶性肿瘤患者死于结直肠癌1,2。术后复发和转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。在实施了根治性手术的结直肠癌患者中,仍有20%50%的患者死于术后肿瘤的局部复发和转移3,4,有研究认为该现象与结直肠癌淋

7、巴结微转移有关。E-Cadherin粘附分子介导细胞粘附的紊乱涉及肿瘤的发展和转移。E-Cadherin表达或功能的丧失与癌细胞丧失分化和较高的侵袭能力有关。本研究通过免疫组化方法检测E-Cadherin粘附分子在结直肠癌和转移灶的表达,以CK20为靶目标,应用RT-PCR法检测结直肠癌淋巴结的微小转移,以探讨结直肠癌浸润转移相关基因的表达与临床分期、浸润转移的关系。探讨结直肠癌组织中E-Cadherin的表达及其与淋巴结微转移的关系,试图对结直肠癌转移做出预测和早期诊断,为临床治疗提供依据和手段。1 实验材料及方法实验材料病例与标本 收集我院20052007年散发性结直肠癌根治术后标本60例

8、,其中男32例,女28例;年龄2879,平均岁。所有患者术前均未行放、化疗;剔除遗传性非息肉病性散发性结直肠癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度:高分化23例,中分化21例,低分化16例;淋巴结转移34例,无淋巴结转移26例;TNM分期I期6例,II期26例,III期22例,IV期6例。术中采集散发性结直肠癌患者肿瘤周围肿大淋巴结共782个,剖开,一半行常规术后病理,另一半保存于-80冰箱备用。选择远癌“正常”大肠黏膜组织(距癌灶4 cm)和癌旁(距癌灶2 cm)大肠黏膜组织各10例作为对照观察。所有标本经10%福尔马林液固定,常规石蜡包埋。本研究得到医院伦理委员会批准,所有患者本人均签署知情同意

9、书。试剂 鼠抗人E-Cadherin单克隆抗体和S-P试剂盒(Zymed公司)。TRIzolReagent(Invitrogen公司),TAKARA AMV逆转录试剂盒(Takara公司),TAKARA LA Taq(Takara公司),PCR试剂(Takara公司),DNA分子量Marker(晶美公司)。方法总RNA的抽提 采用标准TRIzol法(参照说明书)提取术后淋巴结标本的总RNA,凝胶电泳和分光光度计检测RNA浓度和纯度。cDNA制备 总RNA样品1 l,依次加入Oligo dT(18) l,MgCl 2 2 l,10RT Buffer 1 l,RNase Free dH 2Ol,1

10、0 mmol/L dNTP 1 l,RNase Inhibitorl,AMV Reverse Transcriptasel。总反应混合物于30反应10 min,42反应30 min,99反应5 min,5反应5 min。引物的合成 在NCBI数据库中查找编码人类基因CK20的核酸序列,其登录号为NM_019010,该序列长1817 bp,编码序列CDS(Coding Sequence)位于43-1317 bp间。以此序列为基础,在CDS区内设计引物。上游引物5-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC-3下游引物5-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT-3扩增片段为449 bp

11、大小,引物由上海英俊公司合成。PCR反应和分析 采用RT-PCR方法,以人结直肠癌淋巴结cDNA为模版.反应体系为50 l:cDNA模版1 l,10 LA PCR缓冲液5 l,25 mmol/L MgCl2 5 l,20 pmol/l 上游和下游引物各1 l,10 mmol/L dNTP Mixture 2 l,LATag酶 l,补去离子水至50 l。PCR反应条件:94预变性3 min;94变性30 s,退火30 s,72延伸1 min,30个循环;72再延伸5 min。反应完毕后进行电泳分析。结直肠癌组织切片厚4 m, mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复,S-P免疫组化染色。染色步骤按说

12、明书进行,DAB显色,苏木精复染胞核。PBS代替第1抗体作阴性对照。统计学方法 资料的统计分析在软件包中进行,数值变量以均数(95%可信区间)表示,计数资料用率来表示,两组间率的比较采用2检验法。并采用诊断性实验分析方法计算CK20与传统病理切片技术诊断结直肠癌淋巴结转移的准确度、敏感度和特异度。实验结果:图A E-Cadherin在正常大肠黏膜上皮细胞中的表达 40图B E-Cadherin在结直肠癌组织中的表达 402 结果60例散发性结直肠癌患者的782个受检淋巴结经常规病理学检查,34例(%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为356个(%)。而采用RT-PCR法检测CK20 mRNA的

13、表达情况来判断淋巴结转移,结果显示,45例(%)患者有淋巴结转移,较病理学检查结果新增11例,差异具有统计学意义(2=,P=)。阳性淋巴结总数为436个(%),较病理学检查结果新增80个,差异具有统计学意义(2=,)。E-Cadherin表达与结直肠癌临床病理参数的关系 E-Cadherin在癌组织中的表达阳性率显着低于癌旁组织()。E-Cadherin低表达与结直肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移呈正相关()。11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例表达阴性,两者差异有统计学意义(2=,P=)。3 讨论E-Cad

14、herin又称细胞-细胞粘附分子,广泛分布于各类上皮细胞间介导同型细胞间连接的、具有钙依赖性的粘附分子,其在胚胎发育、形态发生、上皮极性和完整性等方面起到重要作用。其表达程度及功能活性状态直接影响细胞的脱落和再粘着,对维持组织结构的完整性、极性及细胞分化等起重要作用。其表达下降时细胞的粘附作用减弱,使肿瘤细胞发生浸润和转移。本研究表明,E-Cadherin在高分化型结直肠癌的表达明显高于未分化型的结直肠癌,提示E-Cadherin与肿瘤的分化有关,可作为分子标记物来鉴别肿瘤的恶性程度。本组资料显示E-Cadherin的异常表达与结直肠癌的病理组织类型无明显相关性,主要考虑与各型腺癌结构的分化和

15、异型程度不一致造成,例如管状腺癌就包括高、中、低分化三种类型。多数学者认为E-Cadherin是肿瘤浸润抑制基因8,9。文献报道,结直肠癌E-Cadherin表达异常与肿瘤分化及浸润深度密切相关,与本研究发现一致。可见E-Cadherin可以作为大肠癌的标志物,协助判断大肠癌的预后。研究证明,淋巴结微转移与患者预后直接相关。CK20是一种独特的I型细胞角蛋白,为具有严格的上皮特异性的癌细胞标志物,可稳定地存在于几乎所有的胃肠道癌及其转移癌中,正常血液及淋巴结的固有成分如淋巴细胞、内皮细胞一般不表达,是检测直肠癌微转移较特异的指标10,11。我们应用RT-PCR检测CK-20阳性率为(%),而传

16、统病理切片诊断为淋巴结转移的阳性率为(%),两组间有显着性差异()。11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(%)E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例(%)表达阴性,两者差异有统计学意义(P=)。本研究提示E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。参考文献1 Maurer CA,Graber Hu,Friess H,etexpression of the metastasis suppressor gene KAI1 in advanced colon cancer and its ,1999,126(5):869-880.Oberg A,Sten