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1、仪器分析实习指导第五章 现代食品安全检测技术第一节 高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素一、实验目的掌握高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素的原理熟悉高效液相色谱法测定蜂蜜中残留的四环素的实验方法了解高效液相色谱仪的基本结构与使用方法二、实验原理（一）四环素是一种广谱抗菌素，可用于治疗和预防一些动物性疾病，但如果长期使用，将导致四环素类药物在动物类组织中的残留。残留在动物类组织中的四环素类药物会影响食用者的健康。四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎作用。因此应严格控制其在食品中的残留量。（二）用酸性的Na2 EDTA-Mcllv

2、aine缓冲溶液将蜂蜜中蛋白质沉淀 ,同时将四环素提取出来，以草酸与乙腈为流动相，C18柱作为色谱柱，反相分离，紫外检测器检测，在四环素的标准曲线的线性范围内，依据其测得的峰面积与其含量间的线性关系进行定量分析。三、仪器和试剂（一）仪器 1. 高效液相色谱仪 2紫外检测器 3涡旋混合器 4离心机 5天平 （二）试剂 1甲醇 2乙腈 3乙酸乙酯 4磷酸二氢钠 5盐酸 6柠檬酸 7乙二胺四乙酸二钠 8草酸四、操作步骤1提取 （1）称取5g试样，置于50mL离心管中，加入30mL0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液,快速混合1min, 以3500r/min离心10min，上清液倒

3、入另一离心管中。（2）将上清液通过固相萃取柱，用2mLNa2EDTA-Mcllvaine溶液冲洗，再用20mL水洗，弃去全部流出液，减压抽干10min，用4mL流动相洗脱，定容至4mL，供液相色谱-紫外检测器测定。 2标准溶液的配制（1）称取四环素10mg，用甲醇溶解，并转移至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得四环素储备液（0.1mg/mL）。准确移取该溶液1mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度,得0.01 mg/mL。准确移取该溶液0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。得四环素标准溶液的浓度分别为0.05，0.10，0.2

4、0，0.40，0.80 g/mL。 3测定（1）色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，150mm4.6mm, 5 m；流动相：0.01mol/L草酸溶液（pH=2.5）-乙腈（80：20）；流速：1mL/min; 柱温：室温；紫外检测器：检测波长：355nm。（2）将上述已制备好的不同浓度的四环素标准系列溶液一次进样20 L，依据四环素的峰面积定量。以标准系列溶液的浓度为横坐标，其相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。（3）样品的测定：取已处理好的样品溶液20 L进样分析，根据峰面积带入回归方程中计算。五、结果计算按下式可计算出蜂蜜中四环素的含量X=CV/m式中：X为试样中四环素的含量

5、，单位为 g/g; C为从标准曲线计算得到的被测组分溶液浓度，单位为 g/mL；V为试样溶液定容体积，单位为mL；m为试样溶液所代表的试样质量，单位为g。六、注意事项（一）流动相使用前必须经过脱气。如果流动相中含有气体，在较高的柱压下会产生气泡，使流动相流动受阻，对分离样品产生不利影响。（二）固相萃取柱使用前应用5mL甲醇和10mL水活化。（陈凌云）第二节 液相色谱-串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考一、实验目的（一）基本熟悉现代食品安全检测技术中高效液相色谱-串联质谱联用技术的测定方法和特点；（二）了解液质联用技术的基本原理以及在食品安全检测中的重要性。二、实验原理氟苯尼考又名氟洛芬、氟甲砜霉

6、素，分子式为C12H14Cl2FNO4S；分子量为358.2127；结构式为。氟苯尼考是一种兽用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。样品中的氟苯尼考在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液经旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经正己烷液-液萃取脱脂。液相色谱-串联质谱仪，以氘代氯霉素（d5-氯霉素）为内标，MRM离子对方式检测，内标法定量。三、试剂和仪器甲醇（HPLC）、乙酸乙酯（AR）、正己烷（AR）、氨水（AR，25%28%）、无水硫酸钠（AR）、氟苯尼考和氘代氯霉素（d5-氯霉素）标准物质（纯度99%）、超纯水。液相色谱-串联质谱仪（API 400

7、0 Qtrap），配电喷雾电离离子源（ESI）；分析天平，感量0.01mg和0.001g；离心机，4000r/min；小型台式离心机，13000r/min；组织捣碎机；匀浆机；减压旋转蒸发仪；涡旋振荡器；聚丙烯离心管：带盖，50mL，1.5mL；鸡心瓶：25mL；具塞比色管等。四、操作步骤（一）标准溶液配制1100g/mL标准储备液的配制：称取适量氟苯尼考标准物质，用甲醇配成100g/mL的标准储备液，于-18冰箱保存备用。2.1g/mL标准储备液的配制：准确吸取1.00mL 100g/mL标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18冰箱保存备用。3.内标标准溶液：氘代氯霉素（d

8、5-氯霉素），100g/mL，溶剂为乙腈，氘化度98%。4.1g/mL内标标准储备液：准确吸取1.00mL内标标准溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容至刻度，于-18冰箱保存备用。5.20ng/mL内标标准中间液：准确吸取1.00mL内标标准储备液于50mL容量瓶中，以超纯水稀释至刻度，于4冰箱保存备用。6.标准工作溶液的配制：分别准确吸取一定量的标准储备液和内标标准中间液，以空白基质溶液配成10、50、100、200、500ng/mL，含内标10ng/mL的标准工作溶液。（二）样品的制备1.标记：从所取样品中，取出有代表性的可食部分约500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器，密

9、封，并标明标记。2.提取：称取5g充分捣碎均匀的试样，精确至0.001g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入内标标准中间液75.0L，加入25mL乙酸乙酯，0.75mL氨水，3g无水硫酸钠，匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中。另取一50mL离心管，加入20mL乙酸乙酯，0.60mL氨水，洗涤匀浆刀10s，洗涤液转移至第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，涡旋振荡提取1min，超声波振荡提取5min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至50.0mL。摇匀后移取10.0mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶，45减压旋转浓缩至干。

10、3.净化：鸡心瓶中的残渣用2.00mL水溶解，涡旋振荡混匀，超声5min，加入3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，移取部分下层的水相至1.5mL的聚丙烯离心管中，13000r/min离心5min，0.2m滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。4.空白基质溶液的制备：称取5g空白样本，精确至0.001g，除不加入内标标准中间液，其它按照样品制备、净化的步骤进行。（三）液相色谱条件1.色谱条件色谱柱：安捷伦 Zorbax XDB C-18，5m，150mm2.1mm；柱温：40；流动相：甲醇-水（4/1）；流速：0.40mL/m

11、in；进样量：10L。2.质谱条件离子源：电喷雾电离离子源（ESI）；扫描方式：负离子；检测方式：多反应选择离子检测（MRM）；质谱条件的优化：以1g/mL的氟苯尼考和氘代氯霉素内标溶液，针泵直接进样，流速5L/min，分别进行MS1、MS2的优化，确定相应质谱参数，选择合适的检测离子对。电喷雾电压(IS)：-4200V；辅助气温度（TEM）：600，其它参数见下表5-2-1：表5-2-1氟苯尼考、氘代氯霉素（d5-氯霉素）质谱参数名 称定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)采集时间（ms）去簇电压DP（V）碰撞能量CE（V）氟苯尼考356.0/336.0356.0/336.0200-75-

12、15356.0/185.0-25氘代氯霉素326.0/157.0326.0/157.0-55-26五、结果计算以内标法定量，在优化的最佳条件下，对基质标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分的峰面积与氘代氯霉素峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分的浓度（或被测组分浓度与氘代氯霉素浓度的比值）为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，得提取液的含量C。按下式计算出蔬菜中被测组分的含量式中：X试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（g/kg）；C从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样品溶液最终的定容体积，单位为毫升（mL）；m称取试样的质量，单位

13、为克（g）。六、注意事项（一）样品采集要均匀、具有代表性；（二）试样要捣碎、匀浆彻底；（三）流动相要过滤、脱气，并现时配制；（四）避免样品污染；（五）色谱柱要充分平衡。（马安德）第三节 电感耦合等离子体质谱法检测茶叶中铅、砷及镉含量一、实验目的（一） 掌握电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定元素含量的原理、分析过程中的各项干扰情况及其消除方法、基本分析步骤（二） 熟悉电感耦合等离子体质谱仪的基本构造及操作（三） 掌握元素（总量）分析的样品前处理方法二、实验原理ICP-MS由进样系统、离子源和质谱仪三个主要部分构成。样品溶液经过雾化由载气送入ICP炬焰中，经过蒸发、解离、原子化、电离等过程

14、，转化为带正电荷的正离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离。对于一定的质荷比，质谱积分面积与进入质谱仪中的离子数成正比。即样品的浓度与质谱的积分面积成正比，通过测量质谱的峰面积来测定样品中元素的浓度。三、试剂和仪器（一）试剂硝酸（优级纯）H2O2（优级纯）纯水：电阻率大于18.0Mcm。铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）混合标准使用溶液：10 mg/L。锗（Ge）、铟（In）、铋（Bi）内标溶液：100 g/L（二）仪器Thermo fisher XSeriesII电感耦合等离子体质谱仪Millipore超纯水制备仪美国CEM Mars微波消解仪及配套消解管和架子精确控温电热

15、消解器千分之一天平100 L、1 mL、5 mL可调移液器各一支，以及相应吸头若干100 mL容量瓶11个、1000 mL烧杯1个、10 mL量筒1个、1000 mL量筒1个四、操作步骤(一) 仪器开机预热（以下步骤基于实验老师将仪器预先调整到Vacuum ready状态下进行）检查Ar气压力是否在0.60.7MPa范围内，排风是否正常，电源是否稳定；打开计算机，启动Windows，打开循环冷却水的电源；双击“Plasma Lab” 图标，进入操作软件主窗口。检查蠕动泵、ICP炬管、雾化室，关闭ICP等离子体发生器窗门；点击on点火；待仪器点火后，预热；（二） 标准溶液系列的制备1. 于100

16、0 mL烧杯中加入594 mL去离子水，再定量吸取6 mL浓硝酸加入烧杯中，搅拌、冷却，配制成（1+99）的硝酸溶液；2. 于5个100 mL的容量瓶中分别加入0、50 L、200 L、1 mL和2.5 mL的铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）混合标准使用溶液（10 mg/L），用（1+99）的硝酸溶液定容至刻度，配制成浓度浓度分别为0、5、20、100、250 g/L标准溶液系列；（三） 样品处理1. 称取0.5g茶叶样品，记下样品具体重量（精确到小数点后第三位），平行样品数为三份2. 将称量好的三份平行样分别放入3支微波消解管中，再取3支微波消解管作制备试剂空白用；每支消解管中分别加入5

17、mL浓硝酸和1 mL H2O2，盖上消解管瓶塞及盖子；6支消解管对称放入微波消解架上，放入微波消解仪中，按照表5-3-1消解程序进行样品消解；表5-3-1 茶叶样品微波消解程序功率爬升时间温度保持800 W5 min1785 min3. 微波消解程序结束后，将消解管放到精确控温电热消解器上进行赶酸操作，温度设定100 ，加热10 h；4. 赶好酸的试剂空白及样品分别转入6个100 mL容量瓶中，每支消解管用少量超纯水清洗35次，清洗液也转移至容量瓶中，最后用超纯水定容至刻度，制备成样品溶液剂试剂空白。（四） 测定1. 使用调谐液调整仪器各项指标，使仪器灵敏度、氧化物、双电荷分辨率等各项指标达到

18、测定要求，仪器参考条件如下：RF功率为1400 W，载气流量为0.93 L/min，采样深度为150 mm，雾化器为同心雾化器、采样锥类型为镍锥，具体仪器条件应该以实际调整所获条件为主；2. 编辑测定方法、干扰方程、选择各测定元素及内标元素、选择校准方法、输入标准系列浓度；3. 引入在线内标溶液，观测内标灵敏度、待内标信号稳定后分别测定试剂空白、标准系列、样品溶液；4. 绘制标准曲线、计算回归方程、获取试剂空白及样品溶液浓度（五） 关机测定完毕，分别用5%硝酸溶液、超纯水冲洗样品管和内标管直至仪器响应值回到基线；点击off熄火，关闭循环水及Ar气，将进样系统的蠕动泵管放松，关闭计算机。五、结果

19、计算茶叶样品中各待测元素的含量由以下公式计算：其中，W为茶叶样品中各待测元素的含量（ g/g）；C样为仪器所测定的样品溶液浓度（ g/L）；为仪器所测定的试剂空白浓度的平均值（ g/L）；m为茶叶样品重量（g）最终茶叶样品中各待测元素的含量应以三个平行样品的含量均值来表示：。其中为茶叶样品中各待测元素的含量均值；SD为标准偏差。六、注意事项（一）干扰及其消除电感耦合等离子体质谱法测定复杂样品时常存在以下干扰，在试验过程中应该注意消除干扰影响。1 同量异位素干扰相邻元素间的异位素有相同的质荷比，不能被四极质谱分辨，可能引起异位素严重干扰，选择待测元素时应避免选择有同量异位素干扰的元素。2. 丰度

20、较大的同位素对相邻元素的干扰丰度较大的同位素会产生托尾峰，影响相邻质量峰的测定。可调整质谱仪的分辨率以减少这种干扰。3. 多原子（分子）离子干扰由两个或三个原子组成的多原子离子，并且具有和某些待测元素相同的质荷比所引起的干扰，本实验中可能存在的多原子（分子）离子干扰见表5-3-2。多原子（分子）离子干扰很大程度上受仪器操作条件的影响，通过调整或者干扰校正方程可以减少这种干扰。表5-3-2 常见的分子离子干扰分子离子质量受干扰元素40Ar35Cl+75AsZrO106112CdMoO108116Cd本实验中，氧化物的干扰可通过调整仪器参数、降低氧化物生成来减少干扰；而As的干扰可以通过干扰校正方

21、程来消除，校正方程为：75As=75Mx 82My (83M-z 83Kr)其中，x、y、z的参考值分别为3.1285、0.8740、1.0074，具体数值以77ArCl、82Se和83Kr的实际仪器响应来计算。4. 物理干扰包括检测样品标准溶液的粘度、表面张力和溶解性总固体的差异所引起的干扰。用内标物可校正物理干扰。5. 基体抑制（电离干扰）易电离的元素增加将大大增加电子数量而引起等离子体平衡转变，通常会减少分析信号，称基体抑制。用内标法可以校正基体干扰。6. 记忆干扰经常清洗样品导入系统以减少记忆干扰。（二）仪器稳定性监测测定过程中，应随时留意内标元素的仪器响应情况，如内标元素仪器响应出现

22、大幅度波动，应查明原因再重新测定。（三）样品制备由于样品赶酸过程较长，样品制备应提前进行。(刘洪涛)第四节 离子色谱法测定自来水中氟离子、氯离子含量一、 实验目的（一）掌握离子色谱法测定自来水中氟离子、氯离子含量的基本原理及实验方法。 （二）熟悉离子色谱仪的测定方法。（三）了解化学抑制的工作原理。二、 实验原理 样品通过进样阀注入仪器，并随碳酸盐-重碳酸盐淋洗液进入离子交换柱系统（由保护柱和分离柱组成），由于样品中各种阴离子对分离柱中阴离子交换树脂的亲和力不同，移动速度亦不同，从而进行分离。已分离的阴离子流经阳离子交换柱或抑制器系统转换成具高电导度的强酸，淋洗液则转变为弱电导度的碳酸。由电导检

23、测器测量出各阴离子组分的电导率，以相对保留时间和峰高或面积定性和定量。 三、仪器和试剂（一）仪器 1.离子色谱仪2.全自动进样器3.阴离子分离柱4.超声波清洗器5.超纯水系统6.真空泵7.过滤器8.十万之一分析天平9.滤膜：0.22mm10.聚乙烯塑料容量瓶：1000m1、100m1（二）试剂 1.氟标准储备液（1000mg/L）2.氯标准储备液（1000mg/L）3.碳酸钠：分析纯4.碳酸氢钠：分析纯5.硫酸：优级纯6.去离子水四、操作步骤（一）水样预处理吸取10mL自来水样过0.22mm孔径的微滤膜过滤除去浑浊物质，然后上机待测。（二）溶液的配制1.氟(10.0 mg/L)、氯(100.0

24、 mg/L)混合标准使用液：分别吸取将氟标准贮备液1m1，氯标准储备液10m1，置于100mL容量瓶中，然后用去离子水稀释至刻度，摇匀。2.氟、氯标准溶液的绘制：准确吸取1、2、5、10、20mL氟、氯混合标准使用液分别置于100mL容量瓶中，最后用去离子水稀释至刻度，摇匀。3.淋洗液的配制(碳酸钠1.8 mmol/L /碳酸氢钠1.7mmol/L)：准确称取碳酸钠0.1908g/L、碳酸氢钠0.1428g/L（于105下烘干2小时，并保存在干燥器内），溶于去离子水中，并转移到1000mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，并经真空泵过滤、除气，备用。4.再生液的配制（50mmol/L）：准

25、确吸取3mL硫酸到1000mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀。5.冲洗液：去离子水。（三）仪器的条件1.柱温：室温2.淋洗液流速：1.0 m L/min3.进样量：20ml（四）样品测定1.装上淋洗液，依次打开全自动进样器、主机、连接色谱工作站的电脑开关。2.调节淋洗液和再生液流速，使仪器达到平衡，并指示稳定的基线。3.建立测定方法。4.待基线走稳后，用氟离子、氯离子的混合标准系列溶液进样（可分别得到两种离子的工作曲线）绘制标准曲线。5.将预处理后的自来水样品注入色谱仪进样系统，记录峰高或峰面积。6.测量完毕后，冲洗柱子。7.关泵。 五、结果计算 根据测出的样品峰面积，仪器可直接在标准曲

26、线上查得各阴离子的质量浓度（mg/L）。如有稀释需乘以稀释倍数。C样=C检稀释倍数式中：C样为样品的质量浓度，单位为毫克每升mg/L；C检为在标准曲线上查出的质量浓度，单位为毫克每升mg/L。六、注意事项（一）由于进样量很小，操作中必需严格防止纯水、器皿以及水样预处理过程中的污染，淋洗液应用去离子水配制，不宜配制太多、放置时间太长。（二）为了防止保护柱和分离柱堵塞，样品必须过0.22mm孔径的微滤膜。（三）每次开机后，观察白色的再生液和冲洗液的废液管是否有液体流出，是否被堵。（四）离子色谱仪长期不用时也要定期用超纯水清洗或将柱子卸下密封保存。（沈梅）第五节 气相色谱-质谱法测定蔬菜中的敌敌畏和

27、甲拌磷含量一、 实验目的（一）了解气相色谱-质谱联用仪的基本结构及原理；（二）了解气相色谱-质谱仪使用的方法；（三）了解蔬菜中有机磷农药的提取方法；（四）熟悉气相色谱-质谱法的定性、定量的方法；（五）掌握内标标准曲线法的定量方法。二、 实验原理样品用乙腈匀浆后过滤，滤液盐析后离心，取上清液经固相萃取柱净化，用乙腈+甲苯（3+1）洗脱，洗脱液浓缩后，用气相色谱-质谱仪测定。气相色谱-质谱仪的工作原理：样品中各组份经气相色谱分离后进入质谱仪，被离子源轰击成不同质荷比（m/z）的碎片离子。碎片离子经过质量分析器后，由离子流检测器检测，并按照m/z的大小输出质谱图，以离子流强度为纵坐标，保留时间为横坐

28、标输出色谱图。利用组分的保留时间和质谱图进行定性分析，用峰面积或者峰高进行定量分析。内标标准曲线法：将待测组分的纯物质配置成不同浓度的系列标准溶液（），分别加入等量的内标物质，在一定实验条件下分析，测得待测组分的峰面积及内标的峰面积，以对作图得内标标准曲线。再将同样量的内标物加入到待测样品中，进样分析，测出，由标准曲线求得待测组分的含量。三、试剂和仪器（一）仪器 GC-MS（2010QPPlus，日本岛津公司)；自动固相萃取仪或手动固相萃取仪；均质器；离心机，电子天平（精度分别为0.001g和0.00001g）；氮气吹干仪；100uL/ 1000uL可调移液器；鸡心瓶；微量进样器。（二）试剂

29、乙腈、甲苯、正己烷、氯化钠，均为优级纯。Envi-18和Envi-Carb活性炭固相萃取小柱（3 mL,0.5 g）。敌敌畏、甲拌磷和环氧七氯标准品 (纯度95%，国家标准物质研究中心)。敌敌畏、甲拌磷和环氧七氯标准母液（1.0 mg/mL）: 精确称取10.00 mg标准物质于10.0 mL容量瓶中用正己烷定容。准确移取敌敌畏和甲拌磷标准母液各1 mL置10 mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，得含0.1 mg/mL敌敌畏和甲拌磷的混合标准溶液。准确移取该溶液0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.05mL于5 mL容量瓶中由空白基质提取液定容，得标准工作液0，0.05，0.10，

30、0.20，0.40，1.00 g/mL。环氧七氯内标工作标准溶液（40.0 g/mL）： 准确移取1 mL环氧七氯母液于25 mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度。四、操作步骤（一）仪器操作步骤：1. 确认处于正常工作状态。2. 对仪器进行调谐，获得调谐报告。3. 编辑检测方法，将检测方法发送给仪器，等待仪器达到设定好的条件。4. 编辑样品测定序列，将标准溶液和样品溶液放于自动进样器样品盘中。5. 仪器稳定后，开始测试。6. 样品测定完毕后，进行数据分析。（二）检测条件色谱柱：Rxi-5ms,30m0.25mm0.25 m；色谱柱温度程序：50保持2 min，然后以50/min程序升温至180，再以5/min升温至280，保持1min,在以50/min升温至300，保持1min；载气：氦气，纯度99.999%，流速：1.0mL/min；进样口温度：250；进样量：1 L；进样方式：无分流进样，4.5 min后打开流阀和隔垫吹扫阀；电子轰击源：70 eV；离子源温度：250。GC-MS接口温度：250；扫描方式：选择离子监测。监测离子见下表5-5-1：表5-5-1 待测组分及内标的定量离子和定性离子化合物名称定量离子（强度）定性离子（强度）驻留时间/s敌敌畏109（100）185（22），145（6）