水稻蛋白质组学研究进展.docx

1、水稻蛋白质组学研究进展水稻蛋白质组学研究进展姓名：王琳 学号：D08038 导师：梁建生教授摘要：蛋白质组学研究是功能基因组研究的重要手段。本文简述了蛋白质组学研究的背景、内容、意义及方法；详述了蛋白质组学在水稻组织器官的发育、亚细胞水平结构，逆境胁迫、激素诱导和突变体的形成等方面的应用研究；同时列出当前日益丰富的水稻蛋白质组数据库，并对水稻蛋白质组学研究进行了展望。关键词：水稻；蛋白质组学；双向电泳；质谱；生物信息学1 蛋白质组学研究的历史和背景 核酸与蛋白质是构成生物体的主要大分子。2001年二月和同年六月分别公布了人类基因组框架图和序列图谱，宣告了一个新的纪元后基因组(即功能基因组)时代

2、的到来12。生命科学家越来越关注如何用基因组研究的模式开展蛋白质组学的研究。蛋白质组（proteome）一词是由澳大利亚科学家Wilkins 于1994年提出来。它源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞、组织或完整生物体所表达的全部蛋白质3 。基因组基本上是固定不变的，然而蛋白质组是动态的，具有时空性和可调节性，能反映出特定基因的表达时间，表达量，以及蛋白翻译后的加工修饰和亚细胞分布等4。因此说，基因是遗传信息的源头，而功能性蛋白是基因功能的执行体。蛋白质组学(Proteomics) 成为功能基因组时代重要的研究

3、手段，构成了功能基因组学研究的战略制高点5。2001年2月成立了人类蛋白质组织（Human Proteome Organization，HUPO）。2 蛋白质组学的研究意义及内容蛋白质组学这一崭新的研究领域已涉及生命科学中的一系列热点领域。它的建立对基因调控机制的分析,细胞分化与发育, 疾病发生与发展,医药靶分子的寻找与分析等方面均具有重要意义。总体上看，蛋白质组研究主要包括蛋白质的表达模式和蛋白质的功能模式两个方面。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容,主要是研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。如蛋白质等电点、分子量及表达量的测定,蛋白质的修饰加工、转运定位等。从而

4、建立起细胞或组织或机体在所谓“正常生理条件下”的蛋白质组图谱和数据库。蛋白质功能模式的研究是蛋白质组学研究的重要目标。一方面,蛋白质与蛋白质、蛋白质与其它生物分子的相互作用是细胞进行信号传导及代谢活动的基础。另一方面,蛋白质的结构是蛋白质发挥其功能的前提,对蛋白质结构的认识也成为了解大量涌现的新基因功能的一个重要途径2。3 蛋白质组学的研究方法 蛋白质组学的核心实验工具主要有：双向凝胶电泳、图像分析和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。3.1 双向凝胶电泳 对于来自于全细胞、组织或生物体中包含几千种蛋白质的混合物的分离、检测和分析是蛋白质组分析的首要目标。1975年OFarrel6 首先

5、建立了等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）分离蛋白质的技术。在此方法中引入固定pH梯度技术（IPG）可以实现等电点仅有0.01 pH单位差别的蛋白质的分离。目前在一张凝胶上能同时分离几千个甚至上万个蛋白质点，因此成为了蛋白质分离中的核心技术。 3.2 图象分析技术 双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化,通过分析软件（如PDQUEST、Image Master）可对数字化的图谱进行各种图像分析,包括图象采集、斑点检测、背景消减、蛋白质在图谱上的定位,蛋白质的计数,图谱间蛋白质差异表达的检测（上调、下调或出现、消失）等7。3.3 质谱技术质谱（Mass Spectrome

6、try）是按照化合物分子离子质荷比（m/z）大小进行分离从而确定化合物分子量的一种分析仪器8。它主要是基于基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）两种软电离方式的发展和成熟。 MALDI-TOF-MS的PMF方法具有高通量、高灵敏度和操作简便等优点,但它不适合分析蛋白质的混合物。与之相比联机HPLC ESI-MS/MS虽然只有较低的高通量分析,但能取得更好的分析结果,而且适合分析蛋白质混合物和蛋白质复合物。新近出现的一种被称为基质辅助激光解吸电离四级飞行时间质谱（MALDI quadruple time of flight）技术综合了肽指纹图谱方法的高通量和串联质谱直接获得肽序

7、列两方面的优点。可用于测定蛋白质或多肽的精确分子量，并能测定较大分子的分子量9。3.4 蛋白质相互作用的方法功能蛋白质组学研究涉及蛋白质的活性，因此需考虑翻译后修饰及蛋白质间的相互作用。目前用来检测蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交系统法，蛋白质芯片法，噬菌体展示技术，表面等离子体共振技术等1013。3.5 蛋白质组生物信息学 生物信息学是蛋白质组学中的一个重要的技术平台，它研究生物信息的采集、加工、分析、存储和传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、工程科学以及生物学的技术、方法分析大量而复杂的生物学数据来揭示生物学的奥秘，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：一是分析和构建双向凝胶电

8、泳图谱，搜索与建立并不断完善蛋白质组数据库，二是基于序列相似性、系统发育谱、结构域融合以及mRNA表达类型的比较从而识别、鉴定蛋白质相关性质14。_三三三33444 蛋白质组学在水稻研究中的应用4.1 水稻蛋白质组学的研究背景水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，养活了世界一半以上的人口15。水稻也是我国的第一大农作物，在粮食生产和国民经济中起着极其重要的作用。水稻是目前已知的禾本科植物中基因组最小的植物，约为430MB16。2002年中国科学家和Syngenta公司的科学家分别发表籼稻和粳稻基因组“工作框架图”15，继后日本和中国的科学家又分别公布了粳稻第1号和第4号染色体的全序列17-18

9、以及籼稻粳稻基因的“精细结构图”，成为基因组学研究的又一个重要里程碑。水稻基因组研究取得的巨大成果为进一步揭示水稻生命活动的规律提供了坚实的基础。水稻蛋白质组学已成为功能基因组学时代的前沿和热点。目前，水稻蛋白质组学虽然主要集中在对水稻各个组织器官及亚细胞基本表达模式的研究，但是水稻环境胁迫应答过程的比较蛋白质组学研究和水稻突变体及激素的蛋白质组学研究也在逐步的深入和发展。4.2 水稻组织器官蛋白质组学研究 水稻蛋白质组的早期工作集中在对各个器官组织进行基本蛋白质表达谱的研究，主要目的是建立蛋白质组数据库，确定一些基因在水稻不同组织、器官和发育阶段表达的特异性，以及基因表达的时空顺序关系等，从

10、而为更进一步研究其生长发育规律提供基础【19-21】。近年来，随着水稻基因组测序完成，用蛋白质组学方法快速、大量、系统、全面地研究水稻的生长发育过程及其调控机理取得了进展。Imin等22分析水稻品种 Oryza sativa L. cv Doongara幼嫩小孢子阶段花药的蛋白质组，鉴定了43种不同的蛋白，其中功能已知的有37种，这些蛋白质绝大多数是一些持家基因的表达产物。Kerim等23比较了不同花粉发育时期水稻花药的蛋白质表达模式，发现有150个蛋白的表达在花粉发育过程中发生了变化。Koller等人24将2-DE加串联质谱与多维蛋白鉴定技术结合起来对水稻叶、根以及种子的全蛋白进行了分离和鉴

11、定。在叶、根和种子中分别鉴定到了1022、1350和877个不同的蛋白质。这些蛋白按它们功能的不同可以分为16类。其中代谢相关蛋白占20.8%，其它蛋白质参与了细胞生长分裂、DNA合成、细胞衰老死亡及防御、细胞信号传导、细胞分化、细胞发生等生理生化过程的调控。最近，Zhao等人25对水稻6个不同发育时期叶片的蛋白质表达模式进行了研究。比较分析显示有49个蛋白点在不同时期的凝胶上发生了显著变化。中高丰度表达的蛋白质随着水稻的生长，其累积量会有所下降，而一些抗氧化蛋白质的累积量则在水稻成熟早期显著降低。目前，已经对水稻的根、茎、叶、叶鞘、花药、花粉、胚、胚乳等器官，以及某些组织的不同发育时期进行了

12、大量的研究（见图1）。图1 已经进行了蛋白质组研究的水稻组织（引自http:/gene64.dna.affrc.go.jp/RPD/database_en.htmL）4.3 水稻亚细胞水平的蛋白质组研究进展亚细胞组学是进行蛋白质功能和定位研究的必经之路。目前水稻蛋白质组学研究也已经深入到亚细胞水平，即研究在一个细胞器内表达的蛋白质组（见图2）。Millar等人26对分离纯化出的完整的水稻线粒体，利用IEF/SDS-PAGE、BN/SDS-PAGE以及RE-HPLC等多种技术手段进行了水稻线粒体蛋白质组的研究。他们一共鉴定出了136个蛋白质，其中有23个蛋白质的功能是未知的。Kristensen

13、等27通过二维液相色谱（2D-LC）和ESI-QTOF的技术手段研究了水稻线粒体在过氧化条件下蛋白质的变化情况。发现对照只有20个被氧化的蛋白质，而处理有32个被氧化的蛋白质。Khan和Komatsu28研究了水稻细胞核的蛋白质组成情况。他们分离到了549个核蛋白，Edman测序和质谱分析鉴定了其中的190个蛋白质。其中信号传导和基因调控相关蛋白占主导地位。Tanaka等29系统地分析鉴定了水稻其它一些亚细胞结构的蛋白质组成。鉴定出的蛋白质有58个质膜蛋白、43个液泡膜蛋白质、46个高尔基体膜蛋白质、146个线粒体蛋白质和89个叶绿体蛋白质。这是迄今为止对水稻亚细胞结构最全面的蛋白质组分析。图

14、2 已经进行了蛋白质组研究的水稻细胞器(引自http:/gene64.dna.affrc.go.jp/RPD/database_en.htmL)4.4 胁迫蛋白质组研究基因的表达受各种环境因子的影响，主要包括生物和非生物因子胁迫等。用各种胁迫处理水稻，可以分离新的蛋白及基因，同时可深入了解水稻对这些环境胁迫的适应机制，对于生产实践具有重要意义。Agrawal等人30利用双向电泳分离技术研究了臭氧胁迫对水稻幼苗的影响。通过比较分析发现，臭氧处理后水稻叶片共有56个蛋白质的表达量发生了变化。表达显著降低的主要是与光合作用相关蛋白质。Shen等31人对水稻幼苗叶鞘应答伤害信号的蛋白组研究表明，水稻伤

15、害48小时后至少有29种蛋白质发生变化，其中10种蛋白质上调或诱导表达，19种蛋白质表达受抑制。在这些蛋白中，胰蛋白酶抑制剂（BBTI）、受体激酶、钙调素相关蛋白是伤害应答相关蛋白，它们在植物的伤害反应中具有重要的生理功能。水稻对于干旱以及盐胁迫条件非常敏感。对水稻叶鞘响应干旱胁迫的蛋白质组研究表明32，有10种蛋白质的表达受促进，2种受抑制，这些蛋白质与抗逆、细胞构建等作用有关。Salekdeh等33提取经过干旱胁迫处理的三周龄水稻叶片蛋白质进行电泳后， 42种蛋白表达在胁迫前后有明显差异。经过鉴定，这些蛋白包括组成细胞干旱应答途径中与蛋白质合成、RNA合成、光合作用和碳代谢、抗氧化等相关的

16、蛋白质。水稻生长对低温条件也非常敏感，特别是在生殖生长阶段，低温会导致水稻花粉败育从而严重影响产量34。Imin等人35研究了低温对水稻花粉发育早期阶段的花药蛋白质表达的影响。通过双向电泳图谱分析，有70个蛋白质在低温处理之后发生了变化。其中，12个为低温诱导新产生的蛋白质，47个为低温上调蛋白质，另外11个为低温下调蛋白质。Yan等人36发现在低温胁迫下水稻小苗叶片上有31个蛋白质下调，65个上调，对其中85个蛋白质质谱检测结果表明有一些为未知的低温响应蛋白。4.5 激素蛋白质组研究 激素在植物一生中起着重要的调控作用,研究植物激素的信号传导和作用机理是蛋白质组学的重要组成部分之一。Moon

17、s等37鉴定了水稻根中3个受ABA诱导的蛋白质,其氨基酸序列测定确定其中2个属于胚胎后期丰富蛋白(LEA)的2组和3组,第三个未知。Shen和Komatsu38将水稻叶鞘用5 mol/L赤霉素处理不同时间后的蛋白经2D-PAGE分离和计算机图像分析,看到33个蛋白发生变化,其中21个蛋白点表达增强,12个蛋白表达减弱,说明赤霉素处理水稻叶鞘起码有30多个基因的产物与之相关。对其中的钙网蛋白(Calreticulin)进行了深入分析,发现它有2个不同等电点(PI)蛋白点,随赤霉素处理时间增加,PI 4.0的蛋白点逐渐消失,而PI 4.1蛋白点浓度则逐渐增加。由此说明钙网蛋白在赤霉素信号传递调节叶

18、鞘伸长中是一个重要组分。Rakwal和Komatsu39用外源茉莉酸(Jasmonic acid)处理水稻的幼苗组织,通过2D-PAGE分析发现在水稻的茎和叶中诱导了新蛋白质。对蛋白质点进行-端和内部测序及免疫杂交分析,发现茎中有28的蛋白酶抑制剂(BBPIN)和酸性的与病理有关的17蛋白质(PR-1)。免疫杂交分析表明茉莉酸处理后这些蛋白质的表达具有组织特异性和发育阶段特异性,说明外源茉莉酸处理可以引起与植物自我防御机制有关的基因在茎、叶组织中的特异性表达。4.6 水稻突变体的蛋白质组学研究突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一,应用蛋白质组学的方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行研究可

19、以揭示一些植物生理生态过程的机制。Komatsu40等比较了水稻绿苗和白化苗的蛋白质2D-PAGE图谱,发现了在绿苗中参与光合作用的蛋白质,而白化苗中仅有此蛋白质前体。而抗坏血酸过氧化物酶只在白化苗中存在,说明抗氧化酶在白化苗中起细胞保护功能。王玉忠等【41】对温敏失绿突变体水稻失绿前后的双向电泳图谱比较表明，失绿部分某蛋白P1特异缺失，而在复绿后，P1正常表达，推测该蛋白与叶绿素代谢密切相关。谢锦云等【42】对不育和可育花药样品通过双向电泳分离，肽质量指纹谱分析及数据库检索，从不育到可育图谱上，明显上调的蛋白质包括几丁质酶，酸性磷酸酶，谷蛋白前体等，明显下调的蛋白有谷氨酸氨甲酰转移酶等。Ts

20、unezuka等【43】对一种cdr2突变体的3个病斑形成阶段用双向电泳分离。与野生型相比，有37个蛋白点差异表达，其中28个点在突变体中表达上调，9个点表达下调。通过质谱鉴定，差异表达的蛋白点与防御作用相关。此外有27个蛋白为代谢酶类，暗示该突变体发生的细胞程序化死亡与活跃的代谢有关。4.7 水稻蛋白质组学生物信息学的发展随着水稻蛋白质组学以及生物信息学的发展，水稻蛋白质组学相关的数据库得到不断地充实完善。水稻蛋白质组学研究相关的主要网站有:SWISS-2DPAGE数据库中国镜像站点（http:/cn.expasy.org/ch2d/），该数据库提供双向电泳参考图谱及在线检索软件等；水稻蛋白

21、质组数据库Rice Proteome Database （http:/gene64.dna.affre.go.jp/rpd/）。这为蛋白质组学研究的深入开展提供了良好的条件。5 结论与展望 作为一门新兴的学科，蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能对探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发将提供重要的理论基础。发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。它的研究方法将出现多种技术并存，各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。目前已经建立了一些水稻蛋白质组的数据库，包括各组织器官，亚细胞及不同发育期的双向电泳图

22、谱。对水稻在各种环境胁迫下以及各种水稻突变体的蛋白质组学研究也是一项重要的研究内容，这将直接有利于改善水稻的品质和产量的相关性。随着高通量技术和生物信息学的发展，随着水稻蛋白质组研究的深入，在阐明诸如水稻生长、发育、进化及代谢调控等生命活动的机制等方面会有重大突破。同时水稻的蛋白质组学研究也为其他禾谷类农作物的功能基因组研究打下坚实的基础。参考文献：1 Lander, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome.Nusbaum & International Human Genome Sequencing Consort

23、ium. Nature, 2001,409:8609212 梁宇,荆玉祥,沈世华.植物蛋白质组学研究进展.植物生态学报, 2004，28（1）:114-1153 Wilkins M R，Williams K L，Appel R D，et a1Proteome research：new frontiers in functional genomicsMGermany：Springer，19974 甄朱.蛋白质组学进展. 生物工程学报,2001,17(5):491493.5 张晓勤, 王慧中. 水稻蛋白质组学研究进展. 湖北农业科学,2005， 6: 106-109.6 0Farrell P HH

24、igh Resolution Twodimensional Electmphoresisof ProteinsJJBio1Chem，1975，(250)：4007-40217 詹显全,陈主初.蛋白质组中蛋白质鉴定技术的研究近况.国外医学分子生物学分从册,2002, 24（3）8 Gary Siuzdak. Mass Spectrometry for Biotechnology. Academic Press, Inc. 1996,1:24.9 Paul R Graves ，et al. Molecular biologists guide to proteomics. Microbiol Mo

25、l Biol Rev. 2002，66(1):39-63 10 Auerbach D，Thaminy S，Hottiger M O，et a1The Post-genomic Ea of Interactive Proteomics：Facts and PerspectivesJProteomics，2002(2)：61 1-62311 Pennington S R，Dunn M JProteonies：from Protein Sequenceto FunctionM钱小红译蛋白质组学：从序列到功能M北京：科学出版社，200212 Hassan MAzzazy E，Highsmith W，e

26、t a1Phage DisplayTechnology：Clinical Applications and Recent InnovationsJ，Clinical Biochemistry2002(35)：425-44513 高志贤,晁福寰.Advance on DNA biosensor.Letters In Biotechnology .生物技术通讯,2000,11(1):455314 陈主初，梁宋平。肿瘤蛋白质组学M。 湖南科学技术出版社,2002:1715 Goff S A, Ricke D, Lan T H, et al. A draft sequence of the rice

27、genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science，2002，296(5)：92-100. 16 Sasaki T. The rice genome project in Japan. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：2027-2028.17 Sasaki T, Matsumoto T, Yamamoto K, et al. The genome sequence and structure of rice chromosome 1. Nature，2002，420：312-316.18 Feng Q, Zhang Y,

28、 Hao P, et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature，2002，420：316-320.19 Zhong B, Karibe H, Komatsu S, et al. Screening of rice genes from a cDNA c atalog based on the sequence data-file of proteins separated by two-dimensional electrophoresis. Breed Sci，1997，47：245-251.20 Komatsu S, Ra

29、kwal R, Li Z. Separation and characterization of proteins in rice suspension cultured cells. Plant Cell Tissue Organ Cult，1999，55：183-192.21 Shen S, Matsubae M, Takao T, et al. A proteomic analysis of leaf-sheaths from rice. J Biochem，2002，132：613-620.22 Imin N, Kerim T, Weinman J J, et al. Characte

30、risation of rice anther protein expressed at the young microspore stage. Proteomics，2001，1：1149-1161.23 Kerim T, Imin N, Weinman J J, et al. Proteome analysis of male gametophyte development in rice anthers. Proteomics，2003，3：738-751.24 Koller A, Washburn M P, Markus L B, et al. Proteomic survey of

31、metabolic pathways in rice. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(18)：11969-11974.25 Zhao C, Wang J, Cao M, et al. Proteomic changes in rice leaves during development of field-grown rice plants. Proteomics，2005，5：961-972.26 Millar A H, Heazlewood J L, Kristensen B K, et al. The plant mitochondrial proteome. Trends Plant Sci，2005，10(1)：36-43.27 Kristensen B K, Askerlund P, Bykova N V, et al. Identification of oxidised proteins in the matrix of rice leaf mitochondria by immunoprecipitation and two-dimensional liquid chroma