海豚链球菌研究进展.docx

1、海豚链球菌研究进展第二章 海豚链球菌研究进展1976年Pier等从亚马逊淡水海豚(Inia geoffrensis)皮下“高尔夫球”样的化脓灶内首次分离得到海豚链球菌（Streptococcus iniae, S.iniae）52。在随后的二十年里在美国、以色列等地时有零星暴发，直至上世纪九十年代，海豚链球菌在全球水产养殖业中的危害逐渐凸显，并被认为是有鳍鱼类重要的病原菌。仅1997年由该菌引起的美国水产养殖的损失估计在1000万美元，全球的损失估计在1亿美元53。到2001年时，全球范围内海豚链球菌感染造成的经济损失已超过10亿美元53。人类感染海豚链球菌的临床病例时有报道，全球至少有25人

2、感染海豚链球菌并表现临床病症54-56。海豚链球菌作为一种潜在的人畜共患病原开始被人们熟悉。本章就海豚链球菌的分类地位、生物学特性、宿主范围、临床症状、致病机理、毒力因子、诊断方法以及防控措施进行简介。1. 海豚链球菌的分类及生物学特性海豚链球菌（Streptococcus iniae，曾用名Streptococcus shiloi），隶属于芽孢杆菌纲（Bacilli），乳杆菌目（Lactobacillales），链球菌科（Streptococcaceae），链球菌属（Streptococcus）。1976年，最早由Pier和Madin从美国旧金山市某水族馆一头亚马逊淡水海豚皮下脓肿中分离并定

3、种52 ，伯杰氏鉴定细菌学手册第九版（1994年）中将其归入化脓性链球菌，ATCC29178为模式菌株。海豚链球菌为圆形或近圆形、呈链状或呈双排列的革兰氏阳性球菌，直径大小为0.20.8m，有时老龄菌呈革兰氏阴性；呈链状排列，链之长短与菌株和培养基有关，一般在液体培养集中链长，固体培养基中链则短；无鞭毛、不形成芽胞。在绵羊血琼脂平板上呈溶血活性。大多数菌株最适生长温度3757，在6.5%NaCl或45时不生长；在5盐水（0.85%）中，该菌可以存活9d，25时可以存活2d，35时可以存活不超过24h58。2. 海豚链球菌的感染与病变症状1958年日本首次证实链球菌侵袭危害养殖鱼类虹鳟（Onco

4、rhychus mykiss）59。此后的二十多年，更多的链球菌感染养殖鱼类或野生鱼类的临床病例被报道，病害集中在美国和日本60-64。此时，海豚链球菌也开始为人们所认知52 。从历史上来看，链球菌属并非鱼类的主要致病菌，直至上世纪90年代以后，包括海豚链球菌在内的链球菌属细菌对野生和养殖鱼类的危害凸显65-67。1994年以后，海豚链球菌成为全球重要的鱼类病原菌之一。近年来，陆续有关于海豚链球菌引起哺乳动物甚至人类的疾病报道68。2.1鱼感染海豚链球菌1976年，一种新的链球菌种被认为是引起旧金山捕获的的亚马逊淡水海豚(Inia geoffrensis)皮下“高尔夫球”样化脓灶的病原体，并命

5、名为海豚链球菌52；1978年Pier等再次从纽约尼亚加拉大瀑布水族馆养殖的一头皮肤受损的淡水海豚上分离到海豚链球菌69；第三次从海豚上分离是1987年在俄亥俄州，但是相关的研究结果直至2003才报道70。在上世纪80年代，日本和新加坡的多篇报道最先对海豚链球菌的感染进行了流行病学的描述60, 71-75。1986年，台湾和以色列由Streptococcus shiloi感染引发的虹鳟（Onchorynchus mykiss）和罗非鱼（Oreochromis speices）的急性脑膜炎，死亡率高达50%76，后来对S. shiloi的基因和表型鉴定认为该菌为海豚链球菌76, 77。从1992

6、年起，每年夏天海豚链球菌都会引起澳大利亚海水网箱养殖的澳洲肺鱼（barramundi）发病78, 79。在美国，海豚连球菌感染养殖鱼类首次报道是1994年在德克萨斯州57和1996年在马萨诸塞州75。海豚链球菌也感染亚洲、中东和哥伦比亚地区60, 73, 80-83。为降低病害经济损失，以色列全球率先实行了罗非鱼的疫苗应用计划84。1995年到1997年，以色列将疫苗成功的应用到虹鳟的养殖，使得由海豚链球菌等引起的病害死亡率从50%降低到5%85。然而，在短期的疗效后，大批海豚链球菌感染病害重新暴发，新分离株与之前海豚链球菌毒株生化特性存在差异，病理损伤上也表现出新变化85, 86。据估计，在

7、全球范围内每年由海豚链球菌感染造成的经济损失就超过10亿美元53。由海豚链球菌引起的重大损失遍及美国，日本，以色列，南非，澳大利亚，菲律宾，台湾，巴林等国。链球菌能感染包括淡水和海水在内的多种野生或人工养殖鱼类30, 87-89，也可感染如斑马鱼，珍珠斑马，小丑泥鳅，非洲丽鱼等观赏鱼类90, 91 。罗非鱼感染海豚链球菌的概率要大大高于其他养殖鱼类92。美国罗非鱼协会认为海豚链球菌是影响罗非鱼养殖业的重要病害92-94。海豚链球菌感染主要表现症状为鱼类的脑膜脑炎。被此菌感染后，病鱼的临床表现表现为单侧或双侧眼球突出，体色发黑，缺乏活力，游动缓慢；眼球充血，角膜混浊，肛门红肿；鳃盖下缘、胸鳍基部

8、、体表的其他部位有出血现象；临死前出现间断性狂游、翻滚或转圈。剖解病鱼，结果发现其脑部充血，有出血点；肝脏淤血，出血，有的有坏死灶；脾脏肿大，呈暗红色；胆囊肿大；肠腔积水78, 95 。并非所有的鱼类感染海豚链球菌都会表现出症状。Bromage等（1999）从眼观健康的肺鱼（barramundi）大脑内分离到了细菌，结果现实，具体可以在无病原症状的情况下携带细菌。其他的研究也证实有携带细菌的感染鱼群存在78, 94, 96。海豚链球菌也常常可以分离自疾病暴发后的幸存鱼体内，这些幸存者很可能成为未来疾病暴发的携带者。2.2人感染海豚链球菌1995年1996年在加拿大的多伦多地区报道四例人感染海豚

9、链球菌感染人的临床病例，然而对于病原的传播途径人们不得而知97 。在随后的研究中，研究人员针对一群处理过鱼的老年人感染的链球菌病进行了描述后98，人们才开始意识到人在有外伤的情况下接触带菌鱼主要是罗非鱼等易感鱼类后很容易感染上链球菌。感染主要症状表现为手的蜂窝织炎，并伴有发热反应。若患有心脏病、肾病、糖尿病和关节炎的病人感染链球菌，会继发更严重的感染。后续研究证实在加拿大、美国、香港和新加坡至少有25例感染被证实是海豚链球菌感染所致54, 56, 98, 99。进一步的调查研究发现，人类感染海豚链球菌通常是由于伤口接触到带菌的鱼体所致100，且感染海豚链球菌的人群平均年龄在69岁，感染者主要是

10、通过手上的伤口或划伤而感染，也有的感染者是由于过度疲劳操作而使得抵抗力低下而易感；健康人感染的风险非常低101。调查显示罗非鱼是海豚链球菌最常见的细菌传播者102。因此，对于有外伤或免疫力低下人群，在接触罗非鱼等链球菌易感水产品过程中需要提高警惕，避免海豚链球菌感染。最简单有效的措施是戴手套并及时用抗菌性药皂清洗手。Lauskp等(2003)认为亚洲人吃生鱼片的饮食习惯加大了海豚链球菌的感染风险56。然而也有学者指出海豚链球菌对公共健康并不存在重大的威胁，其感染人群受条件限制有限且易于预防。但人类感染海豚链球菌的报道，使得近年来对于海豚链球菌的关注和研究开始逐渐深入97, 103。人类感染海豚

11、链球菌主要表现为菌血症、蜂窝织炎、脑膜炎和关节炎56, 102, 104。3. 海豚链球菌致病机理以及毒力因子与水产上的大多数条件致病菌如嗜水气单胞菌等不同，海豚链球菌是非条件致病菌，其侵袭能力更强。但并非所有海豚链球菌都是致病株，也存在不致病的共生菌株。目前，有关海豚链球菌致病机制的研究主要包括动物感染模型的建立105, 106，感染后海豚链球菌在各组织的分布情况95, 107，以及个别毒力因子的研究108, 109。Zlotkin等（2003）认为海豚链球菌的感染首先是同一水系中相关疾病的暴发，使得水环境中或宿主胃肠道中寄生的海豚链球菌侵袭鱼体，进入鱼类的血液循环系统；宿主自身免疫系统不能

12、有效的吞噬杀灭细菌，细菌在宿主体内大量繁殖从而导致疾病的一个复杂多步骤的过程87, 110。而致病株与非致病株PFGE图谱的不同，预示着由一个或几个特异性基因编码的毒力因子是海豚链球菌致病性有无的决定因素。致病性海豚链球菌能够黏附并侵袭宿主细胞，对宿主吞噬细胞具有亲和性，在吞噬细胞中不仅能对抗吞噬细胞的氧化杀灭作用111, 112，而且能在吞噬细胞中存活繁殖，并利用吞噬细胞的保护逃避宿主免疫系统，进入深层组织、血液以及中枢神经系统113, 114。中枢神经系统的感染程度与在血液中的细菌浓度有关，以及细菌溶血时间有关。致病性海豚链球菌能够分泌细胞毒素直接破坏上皮细胞进入血管，并向其他组织扩散。图

13、2-1 海豚链球菌（Streptococcus iniae）毒力因子模式图115Fig 2-1 Virulence factor ideograph of Streptococcus iniae已有研究的海豚链球菌的毒力见图（2-1）115。图中海豚链球菌胞内毒力因子表达基因和胞外毒力因子按顺时针方向依次是，由胞内mgx基因调控表达的SiM蛋白（simA），它包括免疫球蛋白（Ig）和纤维蛋白原（Fibrinogen）；C5a肽酶和白细胞介素-8（IL-8）蛋白酶它们能降解各自对应的化学激化物，从而损坏吞噬细胞；由sivS/R系统调节产生的溶血素S（sag; SLS），能够溶解淋巴细胞（lymp

14、hocytes, L），红细胞（erythrocytes, E）和白细胞（neutrophils, N）；同样受sivS/R系统调节的CAMP因子（cfi）与免疫球蛋白的Fc区域结合，以及荚膜多糖（cps; CPS）合成，EPS形成高度粘稠状的荚膜；此外，-烯醇酶能降解纤维层促进细菌传播。以下对研究较多的几个重要毒力因子作一介绍。3.2细胞溶素S（cytolysin streptolysin S, sag） 溶血素（hemolysins），或称细胞溶素（cytolysins）,是包括链球菌在内的多数致病菌的毒力因子。链球菌的细胞溶素包括溶血素O（streptolysin O，SLO），GAS的

15、溶血素S（streptolysin S，SLS），B群链球菌（Group B streptococcus，GBS）的-溶血素/细胞溶素，以及肺炎链球菌的肺炎链球菌溶血素（pneumolysin），这些溶血素都与致病毒力有关119-122 。研究显示海豚链球菌具有溶解红细胞和损伤宿主细胞膜的溶细胞素123。海豚链球菌在血琼脂平板上形成溶血环，显示出很强的溶血活性。Kawahara等（1989）对海豚链球菌溶血素的产生进行了研究，结果显示在pH7.0的Todd-Hewitt肉汤中25孵育15h时，溶血活性最高。Fuller等（2002）研究表明海豚链球菌溶细胞素是一种链球菌溶血素S（SLS）的功能

16、性同系物。用从GAS提取sag（表达SLS的操纵子）探针与HindIII酶切得海豚链球菌基因组DNA进行Southern杂交，结果显示海豚链球菌中存在于GAS sag操纵子中九个基因同源的序列。研究显示海豚链球菌分泌的细胞溶素由sag操纵子上的9个基因功能编码形成，与GAS的SLS同源性高达73%。其中sagA基因编码的多肽与GAS sagA编码蛋白相似度达73%；sagB编码的蛋白相似性为77%；sagC-F基因与GAS对应基因相似，此外sagG-I基因均编码三磷酸腺苷结合盒（ATP binding cassette-type, ABC）转运体。图2-2 A群链球菌的溶血素S生物合成sag操

17、纵子的9个基因124Fig. 2-2 sag operon of streptolysin S in GASFuller等（2002）用小鼠皮下感染模型检测了海豚链球菌溶细胞素的致病机理。对一株SLS缺失突变株进行小鼠实验证明，突变株与野生株接种相同剂量，致病力无明显差异；而进行坏死性溃疡形成情况的观察发现野生株能够引起小鼠60%坏死性溃疡，而突变株不能引起相应部位的细胞损害。研究结果表明海豚链球菌SLS与局部组织损害有关，但与败血症的建立和菌株对吞噬细胞的抗清楚无关123。Nizet等（2000）研究显示海豚链球菌SLS能损伤红细胞，中性白细胞，淋巴细胞等125。Locke等（2006）研究

18、证实海豚链球菌SLS毒性与吞噬细胞的清除和上皮细胞的粘附侵袭无关126。Reference：52Pier G B, Madin S H. Streptococcus iniae sp. nov., a betahemolytic Streptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin, Inia geoffrensisJ. Int. J. Syst. Bacteriol, 1976,26:545-553. 53Shoemaker C A, Klesius P H, Evans J J. Prevalence of Streptococc

19、us iniae in tilapia, hybrid striped bass, and channel catfish on commercial fish farms in the United States J. Am. J. Vet. Res., 2001,62:174-177. 54Facklam R, Elliott J, Shewmaker L, et al. Identification and characterization of sporadic isolates of Streptococcus iniae isolated from humansJ. J. Clin

20、. Microbiol, 2005,43(933-937). 55Lau S K P, Woo P C Y, Luk W K, et al. Clinical isolates of Streptococcus iniae from Asia are more mucoid and B-hemolytic than those from North AmericaJ. Diagnostic Microbiol. Infect. Dis., 2006,54:177-181. 56Lau S K P, Woo P C Y, Tse H, et al. Invasive Streptococcus

21、iniae infections outsideJ. North America. J. Clin. Microbiol., 2003,41:1004-1009. 57Perera R P, Johnson S K, Collins M D, et al. Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia niloticaT. aurea hybridsJ. J. Aquat. Anim. Health, 1994,6:335-340. 58Perera R P, Johnson S K, Lewis D H. Epizootio

22、logical aspects of Streptococcus iniae affecting tilapia in TexasJ. Aquaculture, 1996,152:25-33. 59Hoshina T, Sano T, Morimoto Y. A streptococcus pathogenic to fishJ. J. Tokyo Univ. Fish., 1958,44:57-68. 60Kitao T, Aoki T, Sakoh R. Epizootic caused by betahaemolytic Streptococcus species in cultured

23、 freshwater fishJ. Fish Pathol., 1981,15:301-307. 61Kusuda R, Kawai K, Toyoshima T, et al. A new pathogenic bacterium belonging to the genus Streptococcus, isolated from a epizootic of cultured yellowtail. J. Nihon Suisan Gakkai Shi, 1979,42:1345-1352. 62Minami T, Nakamura M, Ikeda Y, et al. A betah

24、emolytic Streptococcus isolated from cultured yellowtailJ. Fish Pathol., 1979,14:33-38. 63Ohnishi K J Y. Studies on streptococcal infection in pondcultured fishesI Characteristics of a beta-hemolytic Streptococcus isolated from cultured Ayu and Amago in 19771978.J. Fish Pathol., 1981,16:63-67. 64Rob

25、inson J A, Meyer F P. Streptococcal fish pathogenJ. J. Bacteriol., 1966,92:512. 65Baya A M, Lupiani B, Hctrick F M, et al. Association of Streptococcus sp. with fish mortalities in chc Chesapeake Bay and its tributariesJ. Journal of Fish Diseases, 1990,13:251-253. 66Plumb J A. Major diseases of stri

26、ped bass and rcdfishJ. Veterinary and Human Toxicology, 1991, 33(Supplement 1):34-39. 67Kitao T. Streptoccal infections. In: Bacterial Fish Diseases (ed. V. Inglis, R. J. Roberts & N. R. Bromage)M. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1993. 68Austin B, Austin D A. Chapter 2: Characteristics of

27、 the diseases. In Bacterial Pathogens: Diseases of Farmed and Wild FishM. cUK: Springer-Praxis, Praxis Publishing Ltd. Chichester, 1999. 69Pier G B, Madin S H, Al-Nakeeb S. Isolation and characterization of a second isolate of Streptococcus iniaeJ. Int. J. Syst. Bacteriol., 1978,28:311-314. 70Bonar

28、C J, Wagner R A. A third report of golf ball disease in an Amazon River dolphin (Inia geoffrensis) associated with Streptococcus iniaeJ. J. Zoo Wildlife Med., 2003,34:296-301. 71Foo J, Ho B, Lam T. Mass mortality in Siganus canaliculatus due to streptococcal infectionJ. Aquaculture, 1985,49:185-195.

29、 72Inglis V, Roberts R J, Bromage N R. Bacterial Diseases of FishM. Cambridge: The University Press, 1993. 73Nakatsugawa T. A streptococcal disease of cultured flounderJ. Fish Pathol., 1983,17:281-285. 74Nguyen H T, K K. Selective agars for the isolation of Streptococcus iniae from Japanese flounder

30、, Paralichthys olivaceus, and its cultural environmentJ. J. Appl. Microbiol., 1999,86:769-776. 75Stoffregen D, Backman S, Perham R, et al. Initial disease report of Streptococcus iniae infection in hybrid striped (sunshine) bass and successful therapeutic intervention with the fluoroquinolone antiba

31、cterial enrofloxacinJ. J. World Aquacult. Soc., 1996,27:420-434. 76Eldar A, Bejerano Y, Bercovier H. Streptococcus shiloi and Streptococcus difficile: two new streptococcal species causing a meningoencephalitis in fishJ. Curr. Microbiol., 1994,28:139-143. 77Eldar A, Frelier P F, Assenta L, et al. St

32、eptococcus shiloi, the name for an agent causing septicaemic infection in fish, is a junior synonym of Streptococcus iniaeJ. Int. J. Syst. Bacteriol., 1995,45:840-842. 78Bromage E S, Owens L. Infection of barramundi Lates calcarifer with Streptococcus iniae: effects of different routes of exposureJ. Dis. Aquat. Org., 2002,52:199-205. 79Bro