核酸抽提体会和原理总结.docx

1、核酸抽提体会和原理总结核酸提取原理及体会总结 一、核酸 核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最大体和最重要的成份。一样以为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发觉的。他那时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年熟悉其酸性后，定名为核酸。二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些一起的结构特点，但生物功能不同。DNA贮存遗传信息，在细胞割裂进程中复制，使

2、每一个子细胞同意与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA要紧在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。 核酸的大体结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖组成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸确实是依照其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。下面咱们看看DNA和RNA具体的不同：（一）DNA的分子结构 1. DNA的碱基组成规律：Chargaff等依照分析各类生物及其不同组织内DNA样品水解液中

3、的碱基含量的结果，得出以下结论：1）同一生物不同组织的DNA样品，其碱基成份含量相同。2）不同生物的DNA碱基成份含量不同。3）对某一生物讲，其碱基成份的含量不受年龄、营养及环境转变等阻碍。 4）在同一生物的DNA碱基含量是A=T，G=C，A+G=C+T ，碱基之间的这种关系称Chargaff法那么。2. DNA分子的大体结构：核酸分子内单核苷酸之间的连接键为3,5-磷酸二酯键，是共价键。 DNA分子的大体结构确实是许多脱氧核糖核苷酸借磷酸二脂键彼此连接而成的多核苷酸链。DNA链中碱基 的组成和排列顺序即为DNA的一级结构。DNA的遗传信息即贮存在DNA分子的碱基排列顺序中。 .DNA分子的空

4、间结构：DNA的二级结构是双螺旋结构，其特点为：1）两条链方向相反、彼此平行、主链是磷酸戊糖链，处于螺旋外侧。2）碱基在螺旋内侧并配对存在，A与T配对的G与C配对，A与T之间二个氢键相连（A-T），G与C之间三个氢键相链（G-C）。3）螺旋直径2nm，二个碱基对平面距0。34mm，10bp为一螺距，距离为3。4nm。4）稳固因素主若是碱基之间的氢键和碱基对平面之间的堆积力。（二）RNA的分子结构RNA的大体结构是A、G、C、U四种碱基组成的核糖苷酸通过磷酸二酯键相链而成的多核苷酸链。 有三种要紧的RNA：据其作用可分转运RNA（tRNA）、信使RNA（mRNA）和核蛋白体RNA（rRNA），它

5、们的二级 结构是单链局部双螺旋，共中tRNA结构较清楚：1. tRNA tRNA一级结构特点是：1）核苷酸数量在70-90之间；2）含较多稀有碱基； 3）所有tRNA的3结尾均是-CCA的结构。 tRNA二级结构特点： 呈三叶草形，有三环四臂。其中3的氨基酸臂是携带氨基酸的位置，II环又称反密码环，此环顶端 由3个碱基组成反密码子，起到识别mRNA上关于密码子的作用。2. Mrna mRNA是蛋白质合成的模板，真核生物的mRNA的5端有m7Gppp的帽子，3结尾有20-200多聚A的尾巴上述二者之间为信息区，其中每三个相邻碱基组成一个三联体，代表一个氨基酸信号，即为密码子。不同mRNA具有不同

6、的密码顺序，决定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序（一级结构）。3. rRNA 核蛋白体RNA，它是细胞内含量最多的RNA：rRNA与多种蛋白质结合成核蛋白体，存在于胞浆，是蛋白质 合成的部位。三、核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA那么为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸多数呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一样都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳固。天然状

7、态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。四、细胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取进程中，细胞裂解是超级重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除提供一个适合的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解进程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳固 (如 NaCl) 等。去污剂那么是通过使蛋白质变性，破坏膜结构

8、及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，增进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作和取得更纯的核酸。也有直接利用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方式已经成了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。（二） 细胞的裂解方式细菌细胞破碎方式有以下几种：1）机械方式：超声波处置法、研磨法、匀浆法，关于超声波处置法，要设定好超声时刻和间隙时刻，一样超声时刻不超过5秒，间隙时刻最好大于超声时刻。2）化学试剂法：用含SDS或CTAB的溶液处置细胞，在必然的p H 环境和变性

9、条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相，p H 环境那么由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等) 提供，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必需的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,爱惜核酸不被降解。；3）反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几回，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引发溶胀，使细胞结构破碎。4）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等，都可使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,增进核酸的分离。其中溶菌酶能催

10、化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用常常联合利用。具体选择哪一种或哪几种方式可依照细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确信。（三）裂解方式的评判含蛋白酶的裂解方式，能够以为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋

11、白质的游离有庞大的增进作用；同时，庞大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，那么不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终取得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，若是基因组 DNA与 蛋白质 “缠”在一路，在纯化的进程中有两种可能：若是基因组 DNA 的特性占优势，那么纯化时以 DNA 的形式被保留下来，致使蛋白质的残留；若是蛋白质的特性占优势，那么纯化时以蛋白质的形式被去除，致使 DNA 的损失。固然去污剂裂解方式，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。

12、操纵好裂解液/样品的比例是该方式成功的关键。该方式结合高盐沉淀，能够实现最简单的操作，但纯度及得率的稳固性可能会比用 PC 抽提的差一些。 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方式，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解和基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都可不能对以后的纯化产生大的阻碍，能够不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除极少量不适用该方式的样品 主若是植物，其它绝大部份样品的 RNA 的抽提，都能够以高浓度的蛋白质

13、变性剂为基础的。固然有些样品，如肌肉，即便是 RNA 抽提，也强烈建议利用含蛋白酶的裂解液 (或在操作中的某个时候利用蛋白酶消化蛋白质) ，缘故在于这些样品中的蛋白质，是超级难以去除的。该方式是取得最大得率和最高纯度的基础。 含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方式。该方式成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的完全程度。CTAB 的质量对裂解效率有专门大的阻碍，而且，似乎还说不清楚缘故，因为即便是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，成效就可能不同专门大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB

14、 的少量残留也会对酶活性有庞大阻碍，因此洗涤是不是完全也是该方式成功与否的关键。裂解时的温度，多利用 65C；但如果是发觉降解严峻或得率太低，能够试一下 37C 45C 那个相对低温的区域。 SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方式，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。操纵好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方式成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，因此，加入溶液 III 后在 4 静置一段时刻和采纳 4 离心去蛋白质，都能够提高质量。该方式不必然要利用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，能够取得纯度很高的质粒。RNA 的去除能够靠在溶液 I 中加入 RNase A

15、(100ug/ml) 或在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。总的感觉是，在溶液 I 中利用 RNase A，RNA 的残留少一些。只是，经典沉淀几乎没有方法完全去除 RNA 残留。另外，对大质粒 (50 kb 以上)，该方式可能会有问题。 PCR 模板的简易裂解方式，也是利用面很广的一类方式。该方式的特点是不必纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，超级快速。也正因为不纯化，因此，假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方式最简单的确实是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，PCR检测就能够够了。若是利用裂解法，哪么最简单的裂解液确

16、实是水，复杂一点的就会含有一些可不能抑制后续的 PCR 反映，而且能提高裂解效率，乃至还可能部份排除样品内抑制 PCR 反映杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部份杂质的介质。操作也超级简单，多利用温度的转变来实现样品的裂解，如煮沸、或高温-低温的多次循环等。该方式最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判定某一个样品是阳性仍是阴性。降低样品利用量能够提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。（四）样品与裂解液的比例 选择了适合的裂解液，下一步确实是要操纵好样品与裂解液的比例。那个问题

17、超级重要，但却没有取得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如 1ml 裂解液能够用于 T mg 组织或 C 个细胞；建议:样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并无具体的说法。若是不是样品量有限，那么以能抽提出知足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液能够抽提 100mg 样品，就必然利用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率) 没有关系，但是，在实际操作中，对结果是有比较大的阻碍的。裂解液的用量原那么是：确保能完全裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度太低，将致使沉淀效率低，阻

18、碍得率；浓度太高，去除杂质的进程复杂且不完全，致使纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。五、核酸提取核酸提取包括样品的提取和纯化两大步骤。提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的进程，纯化那么是使核酸与裂解体系中的其它成份，如蛋白质、盐及其它杂质完全分离的进程。（一） DNA提取的几种方式1 浓盐法 ：1）利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，经常使用的方式是用1M 氯化纳提取化钠抽提,取得的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一路摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,现在蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,

19、用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来； 2）也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白。两种方式比较,后种方式使核酸降解可能少一些；3）以稀盐酸溶液提取DNA 时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取进程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。2 阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,能够直接从生物材料中提取DNA 。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,因此经常

20、使用阴离子去污剂提取DNA。3 苯酚抽提法： 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处置匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后掏出水层，多次重复操作，再归并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。现在DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，掏出。此法的特点是使提取的DNA维持天然状态 。4水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA淀溶于水中充分溶解于水中,离心后搜集上清液。在上清中加入固体氯化钠

21、调剂至2.6M，加入2倍体积95%乙醇,当即用搅拌法搅出。然后别离用66%，80%,95%乙醇和丙酮洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一样不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取进程中加入SDS。（二） RNA提取所有的提取进程中都有五个关键点，即）：样品细胞或组织的有效破碎；）有效地使核蛋白复合体变性；）对内源酶的有效抑制；）有效地将从和蛋白混合物中分离；5）关于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。1）总RNA的试剂盒快速提取 一些公司推出的总RNA提取试剂盒,该总RNA纯化系统采纳两种闻名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸

22、弧(GTC)和-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,如此就能够显著降低RNA的降解速度。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合利用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,那么依照Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采纳酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,如此使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,那么有可能对以后操

23、作中的一些酶促反映产生抑制。2）氯化锂法提取总RNA： 本方式用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其专门适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简练的优势，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺点。3 ）蛋白酶热酚法：本方式适合于病毒RNA的提取。六、核酸纯化裂解完成后，液体体系中就包括了游离的核酸、蛋白质及其它大分子杂质、盐：纯化确实是将核酸与其它游离成份分离的进程。就个人所知，目前在科研领域普遍利用的核酸纯化技术要紧能够分为两大类：利用介质的和不利用介质的，利用介质的，一次就将核酸与其它所有杂质分开；不利用介质的，必然是第一将核酸和盐与

24、大分子杂质分开，再通过沉淀核酸使核酸与盐分开 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。利用介质的能够分为两类：离子互换介质和吸附介质。不利用介质的也分为两类：利用苯酚/氯仿抽提的和不利用苯酚/氯仿抽提的。（一）纯化方式：下面比较一下具体的纯化技术：1）经典的利用苯酚/氯仿抽提的纯化技术：细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1 体积) 混合液。依据应用目的，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单倒置混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分派至有机相,核酸那么被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE 缓冲液饱和，因未饱和

25、的酚会吸收水相而带走一部份核酸。酚也易氧化发黄，而氧化的酚可引发核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联;故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛，,以避免酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇那么可减少操作进程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类和去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05.5 ，终浓度为0.3M 的NaAc 或KAc 后，钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中增进核酸的疏水复性。然后加入22. 5 倍体积的乙醇,经一按时刻的孵育，可使核酸有效地

26、沉淀。其他的一些有机溶剂 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。2）利用离子互换介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被联结在离子互换介质上；洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再通过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作，取得纯的核酸，溶解于适合的缓冲液中。3） 利用吸附介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被吸附介质选择性吸附；洗涤去除残留的杂质后，用水或适合的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来，就能够够直接用于后续实验。4) 密度梯度离心法：密度梯度离心也用于

27、核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因此可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备，其中氯化铯2溴化乙锭梯度平稳离心法被以为是纯化大量质粒DNA 的首选方式。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射，产生荧光而被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而取得纯化的核酸。注：可是在日常实验进程中，通经常使用的纯化方式有要紧有以下两种，一是化学方式，即PC 抽提 + 醇沉淀；二是物理方式，即介质纯化。第一种方式是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白

28、质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方式那么是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方式的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。固然，也有不纯化的抽提方式，可是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 如多糖、多酚等 - 的去除，大体上都是在这两种方式的基础上，通过增加一些专门的试剂，或增加一些额外的步骤来实现的。（二） 纯化方式评判PC(P是英文酚的缩写，C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方式，是一个永只是时的方式。稳固、靠得住、经济、方便。PC抽提能够完全去

29、除蛋白质，醇沉淀能够去除盐，关于一样的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方式完全能够取得高质量的核酸。尽管每次 PC 抽提都会损失一部份核酸 (因为不可能将水相全数移取)，和低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都能够靠操作的调整而得以解决或减少阻碍。该方式的最大的问题是不适合大规模抽提。PC抽提是去除蛋白质的一个超级有效的手腕。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀完全，二要用量足够。完全混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人老是担忧混匀的猛烈程度是不是会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，事实上大可

30、没必要如此警惕。猛烈的混匀操作，是会部份打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用可不能强烈到 DNA 变成 10kb 之内的小片段。手猛烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部份会大于 20kb，那个大小，除一些专门的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。若是要求的片段超级大，如构建文库用，那么不能利用猛烈的混匀方式，而只能来回温和倒置混匀 现在的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有必然的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质可不能被一次去除，必需靠多次抽提，方可完全去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以完全去除，和基因组 DN

31、A 会断裂得更厉害，因此要注意裂解液与样品的比例。4C 离心操作有利于更完全去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚能够部份去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时取得 DNA 残留极少的 RNA。只是有一点要提示的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能利用 PC 抽提的，不然核酸必然降解。高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方式，一样也是一个超级不错的方式。与 PC 抽提方式相较，除纯度的稳固性可能要低一点外，该方式几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的益处是，能够用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳固。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些。 介质纯

32、化方式，是一个愈来愈受到重视的方式。其最大特点是超级适合大规模核酸抽提，而且因为受人为操作因素阻碍小，纯度的稳固性很高 (尽管纯度不必然比PC 纯化方式更高)。其致命弱点是样品过量。介质能够分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类那么是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀不同不大，都是通过数次的加液-倒液进程，干燥后，溶解即可取得纯化好的核酸。柱式纯化的操作尽管也是有加液-倒液进程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完满是分开的，因此洗涤更完全，操作更省力 (不用费心将核酸倒掉了，或液体的残留)。只是，介质纯化方式的本钱是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质主若是盐的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一路被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并非是超级特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到必然水平后，都可能同步被沉淀下来。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有必然的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或醇的比例是不可更改的。实际操作中