中草药对大黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响食品科学与工程毕业论文.docx

1、中草药对大黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响食品科学与工程毕业论文-文档均为word文档，下载后可直接编辑使用亦可打印- 要谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase）是一种抗氧化酶，它主要存在于生物机体内，参与机体内的多种生物学过程。本研究以大黄鱼（Larimichthys crocea）为研究对象，通过在基础饲料中添加不同剂量的中草药，研究中草药对大黄鱼GR基因表达的影响。饲喂30d后，以脾脏组织为实验材料，通过采用荧光实时定量PCR技术对不同实验组中GR基因的相对表达水平进行检测。结果如下：与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降，但是各组间均无显著性差异

2、（P 0.05）。本研究结果为中草药作为饵料添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了前期研究基础。关键词：中草药；大黄鱼；谷胱甘肽还原酶；基因表达AbstractGlutathione reductase is an antioxidant enzyme that exists primarily in the organism and is involved in a variety of biological processes in the organism. In this study, Larimichthys crocea was taken a

3、s the research subject, and the effect of Chinese herbal medicine on GR gene expression in L. crocea was studied by adding different doses of Chinese herbal medicine into the basal feed. The expression level of GR gene in spleen of large yellow croaker was detected by fluorescence real-time quantita

4、tive PCR at different doses. The results were as follows: compared with the control group, the expression of GR gene in each experimental group decreased to different degrees, but there was no significant difference between each group (P 0.05). The results of this study provided basic data for the a

5、pplication of Chinese herbal medicine as a bait additive in the feed of Chinese croaker, and also provided the basis for the preliminary study of Chinese herbal medicine as an immune booster for fish.Key words: Chinese herbal medicine; Larimichthys crocea; glutathione reductase; gene expression中草药对大

6、黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响1 引 言1.1 大黄鱼大黄鱼（Larimichthys crocea）属石首鱼科（Sciaenidae），黄鱼属，也叫黄花鱼，石头鱼，为中国某些地方特有的鱼种, 福建沿海地区和浙江沿海地区为主要养殖区域。大黄鱼最适宜成长发育的水温为1825，平时喜欢栖息在沿岸和海水域附近的中等偏下的地方 1 。大黄鱼的体形偏长。侧面较为扁平，体形约为40 cm-50 cm之间，鱼头比较大，下颌相对稍微呈突出的形态。整体颜色为经黄色，大黄鱼的尾巴整体细长，身体上的鱼鳞相对其他鱼而言比较少，大黄鱼的具有很高的营养价值，并且肉质鲜嫩可口，并且大黄鱼还具有很高的药用价值，大黄鱼的耳石

7、可以清除人体内的火气，增加人体肾脏的尿液冲刷尿道对身体健康形成帮助。大黄鱼的膘可以滋润肺和脾，并且可以改善气虚。其胆更有清楚体内火气解除体内日积月累的毒性。鱼鳔可以使其干燥制作成“鱼肚”和“黄鱼胶”，：“鱼肚”是一种有名且昂贵的食品。所以大黄鱼不仅味道鲜美而且又可以改善人体的疾病这使得它广受欢迎。大黄鱼人工繁殖育苗技术自从1985年成功以后，大黄鱼在2012年的时候在全国成为第二大海水鱼养殖品种2，2016年的总产量为17万t，使之成为第一名在海水养殖鱼类产量3。随着大黄鱼幼苗的人工繁殖技术的发展，人们对大黄鱼的繁殖技术掌握和应用程度越来越成熟和充分，为大黄鱼规模化养殖提供了很好的基础条件和技

8、术手段，福建省大黄鱼养殖产量由2006年的40 kt快速增加到2014年的110.45 kt。当前，养殖的大黄鱼已经销售至国内外很多地区,成为福建省的名优水产品之一，为福建带来了可观的经济收入4-6。但是，由于养殖户致力追求养殖大黄鱼的产品数量，并没有考虑大黄鱼的品质质量，于是不断增加网箱养殖规模和扩大养殖大黄鱼的密度，长期喂养不好的料饵和不更新学习饲养管理水平，不考虑生态环境对大黄鱼品质的重要性。造成大面积的连片养殖和水域的生态环境逐渐恶化，结果导致水产品各种疾病的频繁发生，使之整个水产品养殖产业的发展受到了影响。所以通过研究开发能有效提高养殖水产动物的抵抗病毒能力，抵抗氧化能力和免疫力的具

9、有环保效果的饲料添加剂，使之在追求产量的同时也能保证品质质量是目前水产品养殖行业发展的最新趋势。1.2 中草药及太子参的简介中草药（Chinese herbal medicine）也叫中药。中药草的起源在中国，大约有12000种药用植物在我国，我国还经过上千年的研究，中国历史相传，神农尝尽了百种药草，首创了医学。后来我国对于中草药形成了一名独立的学科，本草学。在2020年的此次新型冠状病毒的抵抗中，中草药也起到了重要的作用。中草药能直接抑制病原菌和致病性的低等真核生物的生长和杀灭作用。我国现如今和未来水产养殖疾病防控的重点发展之一是用中草药来防止鱼病。因为中草药本质很天然，残留少，生态环境友好

10、，毒副作用也比较小，而且对耐药性有比较强的抵抗效果。中草药具有多种功能性作用：第一是促进机体的生长发育作用。中草药一般都含有很多营养成分，动物食用后通过消化吸收其中的营养物质，之后在自身体内进行合成和代谢，能够促进机体的生长发育7。第二是增强机体免疫功能作用。在一定程度上保持动物机体发育成长的健康性，减少因机体感染病菌而产生的较大损失，简纪常和吴灶和等8-9在建鲤、大黄鱼的喂养饲料中添加中草药，研究证明中草药明显提高了水产动物的自身所具有的抵抗能力，使水产动物天生具有对一些细菌的抵抗能力。第三是抗应激作用。使水产动物在不太良好的生态环境中也能健康成长。四是抗菌作用。一些中草药能够对病原微生物的

11、生理结构和代谢速率起着一定的影响作用。五是复合作用。相对于单一的中草药，复方中草药可以使其功效显著提高。因此，合理使用中草药免疫增强功能，不仅能够对化学药物和抗生素引起的耐药性问题起着一定的缓解作用，而且可以对水产养殖中的药物残余问题也有一定的改效作用。同时它还可以提高机体的免疫力和动物的抗病能力。所以，研究中草药添加对大黄鱼GR基因表达的影响不仅有利于种质资源的保护而且对养殖大黄鱼种质的改良具有重要意义。太子参也叫童参为石竹科植物孩儿参的干燥块根，太子参适合生长在四季如春，气候温和，湿度湿润的环境，其抵抗寒冷的能力较强，但不适应高温且惧怕强烈的阳光，怕涝，不能浇灌过量的水。太子参适合空气温度

12、在15，地表和地中在10时生长发育，缓慢发芽、发根。如果温度高达30以上则会停止生长，忌讳在同一块土地上连年种植。土地之前种植的产品以甘薯、蔬菜为佳，可与玉米在同一田地上于同一生长期内分行或者分带相间种植。目前太子参多数产于福建柘荣、贵州施秉等地，柘荣县地处福建北部，因其地理环境优厚，种植历史悠久等所产太子参品质上乘，太子参的生产模式主要以种植为主10，太子参品质的高低取决于太子参根块的饱满程度、是否香味浓郁、还有就是含糖量的高低。太子参的药物性质相对平和，可以滋润呼吸器官，分泌唾液，增益津液、有利于人体气机顺畅、健脾和胃的功效、增加机体的免疫能力和抵抗细菌的能力，类似人参之效。动物机体所必需

13、的氨基酸在太子参中含量很高，太子参总氨基酸含量约为7.67%11.95%，必需氨基酸约占3.19%4.11%，药用氨基酸约占5.15%，其中谷氨酸含量（2.49%），精氨酸（2.08%）和天冬氨酸含量在太子参中含量相对较高，同时太子参还含有-氨基丁酸，约占比1.65%11，同时临床药理结果显示太子参具有抗氧化、抗炎、抗应激、增强免疫力和改善机体组织器官功能等作用12-13，因此太子参氨基酸在养殖动物机体的生理调节方面具有重要应用前景。1.3 谷胱甘肽还原酶谷胱甘肽还原酶（Glutathione Reductase），在细胞自身的氧化过程中，起到一定的保护作用，可以保护细胞本身免受于氧化，在细胞

14、内部氧化过程中的产生的氧化产物中，比如自由基和过氧化氢，这两种成分会破坏细胞的内部结构或者细胞成分，使细胞变异和老化的更快。谷胱甘肽还原酶可以有效的清除自由基和过氧化氢，清洁和进化机体内的环境污染，但其本身会在这一过程中被氧化，谷胱甘肽(GSH)能够清除机体内的O2-及H2O2等，由半胱氨酸，甘氨酸和谷氨酸组成的三肽组合物，是机体组织主要的非蛋白质巯基化合物，也是机体内高效的低分子清除剂,因此谷胱甘肽是衡量机体抗氧化能力的关键指标，在保证巯基蛋白的还原性、防止血红蛋白氧化、巯基结合蛋白活性的保持及维持细胞的完整性起着关键的作用14。GR作为一种重要的抗氧化酶，它将还原型谷胱甘肽(GSH）氧化为

15、氧化型谷胱甘肽（GSSG)是通过利用还原型辅酶作为唯一的还原力和电子供体进行的，以此来抵抗氧化应激15。防止GSSG和其他二硫化合物的积累，以及对酶、细胞膜和蛋白质的稳定性起着至关重要。因此，GR对GSH的再生、维持胞内高比率GSHGSSG及平衡生物体内氧化还原有重大的意义，在抗逆性甚至整个生长发育过程中起着关键作用。本论文以大黄鱼为研究对象，尝试将以太子参为主的中草药作为饵料添加剂应用在大黄鱼饲料中，通过分析大黄鱼体内谷胱甘肽还原酶基因表达的变化，在一定水平上分析中草药添加剂对大黄鱼抗氧化酶系的影响，也为中草药影响鱼类免疫的研究提供基础数据。2 材料和方法2.1 材料、药品及仪器 2.1.1

16、 原料鱼的处理实验所用大黄鱼取自于宁德市鼎诚水产有限公司自行繁殖养育的健康、规格一致，平均体长（23.450.83）cm，体质量（34.058.23）g的大黄鱼幼鱼。原料鱼总共分六组饲养分别为：1、2、3、4、5、6（CK），养殖在1.5 T养殖桶中，养殖周期30 d，实验组饲料中添加的太子参及其他中草药浓度见表2-1。每组设置1个平行组，每组100尾大黄鱼幼鱼。每天分2次投喂鱼体质量1%2%的饲料，根据摄食情况酌情进行调整。养殖水体水温控制在2426之间，溶解氧大于5.0 mg/L，pH值维持在8.0左右，氨氮小于0.2 mg/L。常规养殖管理，做好养殖记录。30 d以后，每组分别随机取三尾

17、健康个体进行活体解剖采样，取脾脏组织保存于Trizol裂解液，-80超低温冰箱保存备用。表2-1实验鱼各组饲料用料组成组别组分用量（%）1太子参0.52太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天各0.167（总1.0）3太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天太子参0.5其他各0.1（总1.0）4太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓各0.111（总1.0）5太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓、太子参0.5其他各0.0625（总1.0）2.1.2 试剂TB Green Premix Ex Taq TM (Perfect Real time)、rTaq DNA

18、Polymerase、购自大连宝生物公司。dNTP购自大连宝生物公司。Trizol试剂购自生工。DNA Marker购自北京博迈德科技发展有限公司。引物由上海生物科技公司合成。2.2 方法2.2.1 总RNA提取Trizol法提取RNA具体流程参照说明书，具体如下：（1）取1.5 ml EP管加入30-50 mg脾脏样品，用移液枪加1mLTrizol，冰上破碎成浆；常温放置3 min，412000g离心5 min。（2）取清液层加氯仿（1/5上清体积），混匀，常温等待5 min，4，12000 rpm离心5 min。（3）取清液层以后再吸取同体积经预冷后的异丙醇，用移液枪吸取混匀后，在-20静

19、置20 min，再在4下12000 rpm离心10 min左右。取上清液时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液，若取到则对后续RNA纯度品质造成污染。（4）倒清液层加1 mL75%乙醇（预冷），412000 rpm离心5 min，干燥（需干燥至EP管壁没有余存乙醇，若余下乙醇较多可以用灭菌过的枪头吸出，沉淀由实体转至渐透明之间，则干燥完全），加无核酸酶水20-30 L，-80保存。2.2.2 RNA凝胶电泳（1）制胶：称取4.8 g琼脂糖，加40 ml 1XTAE电炉加热溶解放凉加入4 L核酸染色剂，倒入制胶模具，待凝固成型。（2）点样：将RNA样品顺离与RNA Loading B

20、uffer混好，将混好的RNA样品点入胶孔中，每加完一个样要换一个枪头，加样时防止碰坏凝胶与气泡的产生。设定程序121 V 15 min，开始电泳。（3）将电泳完成的胶用凝胶成像系统观察，验证其完整性。2.2.3 RNA定量分析将RNA样品至于超微量分光光度（Thermo Scientific）下，测定样品在260和280 nm下分别的吸收值，记录RNA样品浓度OD值用于后续实验，本次实验测定RNA OD均值在1.7-2.16之间，说明RNA纯度较高可进行下一步实验。2.2.4 RNA反转录取经过-80保存的RNA样品顺离，按照PrimeScript IV 1st strand cDNA Sy

21、nthesis Mix（Takara）说明书合成第一链cDNA，总反应体系为10 L（如表2-2）。表2-2反转录各引物名称用量（L）5Buffer2Enzyme Max 0.5OligdT0.5Random 6 mers0.52.2.5 实时荧光定量PCR根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物，以-actin作为内参基因(引物序列表2-3)，采用TB Green 预混合 Ex TaqTM (Takara)试剂盒，以相对荧光定量PCR方法检测基因，每个反重复两次。12.5 L反应体系如下：6.25 L TB Green 预混合 Ex TaqTM (TaKaRa)，上下游引物均为0.5 L（

22、2 M），取1 L的cDNA 进行1:10稀释，4.25 L 水。循环参数：在温度为95摄氏度下预变性五分钟，进行40 个循环：95 15 s，60 45 s。PCR反应后分析熔解曲线。重复两次实验，取平均值进行分析。所有基因的相对表达量用2-Ct 计算，所得数据用SPSS 19.0 （社会科学统计软件包）统计数据，然后采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）平均值的差异显著性（P0.05）。表2-3 大黄鱼实时荧光定量PCR引物基因名称gene name正向引物forward primer (5-3)反向引物reverse primer (5-3)谷胱甘肽还原酶 GR-肌动蛋白 -a

23、ctinAGCCAAAACAGCCGTGATTCGTCGGTCGTCCCAGGCATCGGCTAACATAAGCATCCCATGGCGTGGGGCAGAGCGT3 实验结果及分析3.1 总RNA纯度及完整性分析不同组织中总RNA样本在由1%琼脂糖凝胶的电泳检测中显示，RNA无明显降解，每个RNA样本的OD260/OD280值均为1.82.0，此数据说明总RNA纯度较好；18S和28S条带清晰，总RNA具有较高的完整性，可继续用于后续实验。图3-1显示了不同组织中总RNA样本的电泳结果。图3-1不同个体总RNA电泳图（部分）表3-1RNA的定量结果Table 3-1 The quantity a

24、nd quality of RNA样品编号OD260/280浓度（g/L）样品编号OD260/280浓度（g/L）Sp-E1-11.940.51Sp-E4-12.080.80Sp-E1-22.121.16Sp-E4-22.021.38Sp-E1-32.041.25Sp-E4-31.950.84Sp-E2-11.751.62Sp-E5-12.121.05Sp-E2-21.930.93Sp-E5-21.931.33Sp-E2-32.061.10Sp-E5-31.931.22Sp-E3-11.891.40Sp-C11.950.45Sp-E3-22.110.90Sp-C21.520.10Sp-E3-3

25、2.040.92Sp-C31.540.61注：Sp（Spleen）为脾脏，E为实验组C为对照组3.2 熔解曲线分析特异性引物进行熔解曲线分析如图3-2所示，发现熔解曲线呈现单峰，说明引物特异性较好，定量结果准确。图3-2 GR溶解曲线分析结果3.3 谷胱甘肽还原酶的基因表达水平3.3.1 中草药在大黄鱼脾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平图3-3 中草药在大黄鱼脾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平从图3-1中可以看出，与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降，E1、E2、E3、E4组的GR基因表达量的下降程度差不多，均在40%-50%之间，E5组的表达量下降最少只有6%，但是

26、各组间均无显著性差异（P大于0.05）。4 讨 论4.1 中草药添加剂相关应用与前景中草药添加剂具有不容易对药物产生耐受性，并且天然环保、没有残留，非特异性抗菌等优点。中草药添加剂之所以能保持了物质本身的组成和结构的自然状态和生物活性，是因为其由天然的动物、植物、矿物及其产品组成。机体对其吸收和利用的优势是化学添加剂无法比拟的。中草药添加剂不仅具有营养和维持机体健康的功能。还能预防和治疗疾病。现在，许多实践已经证明了这一点。同时，现代医学证明，中草药的药物成分能够对病原细菌的代谢功能起着一定的干扰以及破坏作用。此外，中草药添加剂还能保护环境，因为大多数中草药都是经过人工栽培的草药或者是纯天然的

27、植物，当成添加剂用在饲料里一般不会造成残留和污染。4.2 投喂中草药对大黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响分子氧的单电子还原，酶促催化以及某些生物物质自动氧化均可生成自由基16。生物衰老和某些疾病如癌症、心血管疾病、糖尿病等都是由于自由基和自由基诱发导致的氧化反应而引起的17-20，中草药中包含有许多抵抗自由基的抗氧化物质成份。中草药所具有的特别医疗效果和中草药能作为抗氧化剂有效的全部清除体内自由基的作用有密切的关系。谷胱甘肽还原酶是动植物中重要的抗氧化酶，其功能是利用还原型辅酶 II(NADPH)作为电子供体，使其氧化性谷胱甘肽成为还原性谷胱甘肽。21还原型谷胱甘肽(GSH)中的活泼巯基可以清

28、醒消除动植物体内的自由基，其是细胞内最重要的抗氧化物。它又很容易被氧化脱去氢，在谷胱甘肽氧化酶的作用下，自身被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)。氧化性谷胱甘肽在谷胱甘肽还原酶作用下参与抗坏血酸一谷胱甘肽的循环途径，又被还原为还原型谷胱甘肽(GSH)，此过程能够长时间循环清理消除动植物体内的自由基。因此，谷胱甘肽还原酶可以维持生物体还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽比值的稳定、保持体内氧自由基平衡22本论文通过在基础饲料中添加太子参等中草药，饲喂大黄鱼，分析谷胱甘肽还原酶基因的相对表达变化。首先先分析中草药对大黄鱼脾组织中谷胱甘肽还原酶基因表达的影响。不同实验组中的表达结果显示，饲喂过中草药的大黄鱼

29、，GR基因的表达发生变化，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降，E1、E2、E3、E4组表达量的下降程度差不多，只有E5组表达量下降最少（太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓）。4.3 总结从本实验得出结果：大黄鱼在投喂中草药添加剂之后，其脾组织的GR表达量均呈现不同程度的下降，但各组之间均无显著性差异，说明中草药的有效成分可以抑制生物体内的自由基和氧化反应，从而使得基体自身不受上述中反应的损害。实验结果得出脾和肾两种组织的GR表达量均呈现不同程度的下降，分析其中有种原因：第一，观察基因表达水平，还会反映在蛋白质水平和酶活性水平上，有可能出现基因表达下降，酶活性水平

30、上升的情况，所以下一步计划打算再从酶活性表达水平上看蛋白质表达是否上升。第二：我们实验所用的中草药不是纯一种中草药，是混合多种中草药的添加剂。其中成分作用不一，加在一起可能无单一中草药效果好，中草药相互之间可能产生排斥作用，活性效果不理想。参 考 文 献1张帆, 张文兵, 麦康森, 等. 饲料中豆粕替代鱼粉对大黄鱼生长、消化酶活性和消化道组织学的影响j中国海洋大学学报: 自然科学版, 2012, 42(增刊) : 7582. 2农业部渔业渔政管理局. 2011中国渔业统计年鉴M. 北京: 中国农业出版社, 2011: 28. 3农业部渔业渔政管理局. 2017中国渔业统计年鉴M. 北京: 中国

31、农业出版社, 2017: 26. 4China Fishery Statistical YearbookM. Beijing: China Agriculture Press, 2013; 2015: 32. 中国渔业统计年鉴M. 北京: 中国农业出版社, 2013; 2015: 32. 5Wang J, Ai Q H, Mai K S, et al. Dietary chromium polynicotinate enhanced growth performance, feed utilization, and resistance to Cryptocaryon irritans in juvenile large yellow croaker (Larmichthys crocea) J. Aquaculture, 2014, 432: 321326. 6HuangXH, Sun, Z Y, Guo G W, et al. Cloning and characterization of a surface an