离子交换树脂分离提纯苦豆子生物碱.docx

1、离子交换树脂分离提纯苦豆子生物碱前 言苦豆子总生物碱中含有苦豆子所包含的绝大多数种类的生物碱。苦豆子生物碱为其良好药物活性被广泛用于临床,不仅具有抗癌、抑癌、抑制和杀灭各种微生物作用,而且对免疫系统、神经系统、心血管系统有广泛的药理作用。总生物碱的提取方法有多种,主要有乙醇提取法、水提取法、酸水提取法及阳离子交换树脂提取法等等。目前，国内关于苦豆子生物碱的纯化方法，多用酸水萃取法，用离子交换大孔吸附树脂分离纯化苦豆子生物碱的研究尚未见报道。因此，本文着重研究了用离子交换大孔吸附树脂分离纯化苦豆子生物碱的工艺条件，以期找出一种经济有效、适合大规模工业化生产的分离纯化苦豆子生物碱的方法，旨在为以后

2、进一步研究苦豆子生物碱提供理论依据。离子交换法的优点如下：有机溶剂用量少，离子交换树脂再生后可反复使用；所得生物碱纯度高。缺点是苦参类生物碱与树脂的结合力强，不能将生物碱完全洗出，所以主要生物碱的损失较大2。利用非极性大孔树脂DF01直接从苦豆子酸浸取液中离生物碱，生物总碱的吸附量和解吸率分别为17mg/mL和96%，分离效果较好，该法的优点是生物碱吸附速度快、解容易、树脂的寿命长2。鉴于此，我们综合离子交换树脂和大孔吸附树脂的优点，采用离子交换大孔吸附树脂来富集分离苦豆子生物碱。本实验通过离子交换大孔吸附树脂对苦豆子中的生物碱进行分离，先通过静态吸附与解吸实验选出最佳树脂及最佳吸附时间；然后

3、通过动态吸附实验考察上柱量、上柱流速、上柱液pH值等因素对吸附率的影响，确定最佳上柱条件；由最佳条件上柱，考察洗脱液、洗脱液乙醇浓度、洗脱流速等因素对解吸率的影响，找出最佳的解吸条件，从而达到为进一步研究苦豆子生物碱提供借鉴的目的。第一章、综述1.1 离子交换树脂的发展离子交换树脂是最早出现的功能高分子材料，其历史可追溯到二十世纪30年代。1935年英国的Adams和Holmes3发表了关于酚醛树脂和苯胺甲醛树脂的离子交换性能的工作报告，开创了离子交换树脂领域，同时也开创了功能高分子领域。离子交换树脂可以使水不经过蒸馏而脱盐，既简便又节约能源。因此根据Adams和Holmes的发明，带有磺酸基

4、和氨基的酚醛树脂很快就实现了工业化生产并在水的脱盐中得到了应用。1944年DAlelio合成了具有优良物理和化学性能的磺化苯乙烯-乙烯苯共聚物离子交换树脂及交联聚丙烯酸树脂，奠定了现代离子交换树脂的基础。此后，Dow化学公司的Bauman等人开发了苯乙烯系磺酸型强酸性离子交换树脂并实现了工业化；Rohm&Hass公司的Kunin等人则进一步研制了强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂。这些离子交换树脂除应用于水的脱盐精制外，还用于药物提取纯化、稀土元素的分离纯化、蔗糖及葡萄糖溶液的脱盐脱色等。离子交换树脂发展史上的另一个重大成果是大孔型树脂的开发。20世纪50年代末，国内外

5、包括我国的南开大学4，5化学系在内的诸多单位几乎同时合成出大孔型离子交换树脂。与凝胶型离子交换树脂相比，大孔型离子交换树脂具有机械强度高、交换速度快和抗有机污染的优点，因此很快得到广泛的应用。1.2 离子交换树脂的反应机理离子交换树脂的交换反应与溶液中的置换反应相似，是可逆反应。这种可逆反应并不是在均相溶液中进行，而是在固态的树脂和水溶液接触的界面间发生的。利用固载在聚合物骨架上的功能基所带的可交换的离子在溶液中能发生解离，如磺酸树脂上可离解出氢离子，这种离子可在较大的范围内自由移动扩散到溶液中。同时，在溶液中的同类型离子也能从溶液中扩散到聚合物的网络和孔内。当这两种离子的浓度差较大时，就产生

6、一种交换的推动力使它们之间发生交换作用，浓度差越大，交换速度越快。利用这种浓度差的推动力关系使树脂上的可交换离子发生可逆交换反应。当固态树脂上的可交换离子（如H+）被交换后，这时树脂处于饱和状态。当把溶液变成高浓度的酸时，H+又能把树脂上的其它阳离子交换下来，这时就是树脂的“再生”。由于离子交换树脂中聚合物骨架的稳定，使可逆交换反应能在树脂反复进行，使用寿命长。在工业生产过程中，可以简化生产流程，缩短生产时间，提高生产效率和产品质量6。1.3 离子交换树脂的应用溶剂提取分离技术是天然产物分离的经典技术，但溶剂耗量大，分离效率低，环境污染严重，操作安全性差，一般仅适用于实验室小量样品的制备，而不

7、宜用于工业生产。随着分离科学与技术的进步，离子交换树脂提取分离技术在天然产物提取分离中的应用逐渐增加。1.3.1 离子交换树脂法提取分离氨基酸氨基酸是一类含有氨基和氮基的两性化合物，在不同的pH条件下能以阳、阴或两性离子的形式存在。因此，应用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均可富集分离氨基酸。天然氨基酸主要来源于蛋白质水解液或徽生物发酵液，随其来源不同，体系中氨基酸的含量与伴生杂质的类型也有所区别，因此提取分离工艺也不尽相同。猪血粉、毛发、酪蛋白(乳酪素)、低档明胶、蚕衣、鱼皮鱼鳞等水产废弃物皆可用作生产氨基酸的原料。马建标7等将原料以610mol/L盐酸在100120水解1224h，即生成混合

8、氨基酸溶液。根据生产要求，可用离子交换树脂法从溶液中富集和纯化混合氮基酸，所得产品可用作复合氨基酸注射液或口服液;也能从其中分离出一种或多种纯氨基酸，供药用或食用。自然界中尚存在大量的非蛋白氨基酸，具有药用价值的就有40余种。如美舌藻中的海人草酸、使君子种子中的使君子氨酸和南瓜子中的南瓜子氨酸均是具有驱蛔虫作用的中草药有效成分。它们可用温水、乙醇或乙酸的水溶液提取，然后用强酸性阳离子交换树脂如Zerolite 225进行富集和纯化，得到高纯度的产品8。牛磺酸在动物体内存在甚广。日本专利9介绍了一种从牡蛎中提取分离牛磺酸的工艺，即将牡蛎磨碎后以沸水提取，提取液通过Dowex-99、Dowex-8

9、8、Dowex-66及DowexTG-55A等一组离子交换柱，最终得到纯度90%的牛磺酸。1.3.2 离子交换树脂法提取纯化抗生素在发酵液中，抗生素的浓度很低，提取时溶剂消耗高，效率低;利用离子交换树脂可以选择性地吸附分离多种离子型抗生素，不仅回收率较高，而且产品纯度较好。关于离子交换树脂对抗生素的吸附性能，苏联学者10进行了大量的研究。抗生素分子中往往含有多种化学基团，在强酸或强碱条件下容易发生化学变化，导致药理活性丧失。因此，提取分离所用的离子交换树脂主要为弱酸性阳离子交换树脂或弱碱性阴离子交换树脂。即使偶尔用到强酸或强碱树脂，通常也先将阳离子交换树脂转化为Na十型或NH4+型，将阴离子交

10、换树脂转化为Cl一型或SO42-型。离子交换树脂对抗生素离子有较大的选择性，选择系数比无机离子如Na十或C1一等往往要高出l3个数量级;其原因是抗生素离子与离子交换树脂能以多种键型发生吸附作用。除正常的离子静电作用外，抗生素与树脂骨架间的疏水作用、杭生素分子中极性基团与树脂上化学基团的氢键或偶极键作用等对提高其选择性起着重要作用。抗生素的分子体积较大，大孔网状树脂有利于大分子的扩散与吸附，有较大的吸附量。因此适于提取分离抗生素。1.3.3 离子交换树脂法提取分离生物碱生物碱是许多中草药的重要有效成份。它们在中性或酸性条件下以阳离子形式存在，能用阳离子交换树脂从其提取液中富集分离出来。钩吻总生物

11、碱具有良好的抗癌作用，其树脂法提取分离工艺所得浸膏总收率为1.07%，纯度96%11离子交换树脂吸附总生物碱之后，可根据各生物碱组分的碱性差异，采用分步洗脱或分步提取的方法，将其中的各种生物碱组分一一分离。与溶剂法相比，离子交换树脂法提取分离生物碱具有许多优越之处，不仅操作简便、消耗低，而且产品纯度好、收率高，更适于工业化生产。此外，其它天然碱性化合物(如肌苷)及具有季铵盐结构的天然有机物(如胆碱磷酸甘油酯)也可用类似工艺提取分离与纯化。1.3.4 离子交换树脂法提取分离天然酸性有机化合物 应用阴离子交换树脂，可从动植物中和微生物发酵液中提取分离天然有机酸。乳酸在食品、医药和有机化工领域具有广

12、泛用途，近年来市场需求量逐年增加。以葡萄糖为碳源发酵生产乳酸，从前采用钙盐法分离，生产周期长，产物收率低。王子镐12研究了强碱性阴离子交换树脂#201x4、D290、D296及弱碱树脂D370和D380对乳酸的吸附性能后，发现#201x4阴离子交换树脂(C1一型)具有较高的吸附量和良好的选择性，适合于从发酵液中提取分离乳酸。另据报道，郑一舟等13以弱碱树脂聚乙烯吡啶提取分离乳酸，因无机离子不产生吸附作用，有利于提高产品质量，而且吸附在树脂上的乳酸容易用甲醇解吸。应用树脂法提取分离工艺生产乳酸，生产周期短，产品回收率高。柠檬酸是重要的食品添加剂，从前也用钙盐法从发酵液中分离，消耗大，成本高。朱珍

13、等14使用交联聚丙烯酸甲醋进行多乙烯多胺胺解和甲基化，合成了新型大孔弱碱树脂D280，用于从发酵液中提取分离柠檬酸，结果表明树脂法可提高柠檬酸的回收率。A-酮基-L-古龙酸为维生素C生产的中间体，它由山梨醇经两步发酵制备，过去用浓缩结晶法得到纯品。沈金玉等15采用阴离子交换树脂法提取分离a-酮基-L-古龙酸，用硫酸/甲醇解吸，取得了良好的结果。在D296、D370、D70l和PVP402树脂中，氨基树脂D296和聚乙烯吡啶树脂PVP402呈现最好的吸附和解吸性能,有希望用于VC生产。为纯化粘康酸(已二烯二酸)，可使发酵液依次通过吸附树脂Diafon HP20柱和强酸性阳离子交换树脂Diaion

14、 SK102柱先除去杂质，然后吸附在弱碱性阴离子交换树脂Diaion WA30柱上，经水洗涤后，以稀氢氧化钠溶液解吸，产物粘康酸的收率为95%，纯度达到99.6%16。1.3.5 离子交换树脂法提取分离多肽、蛋白质和酶多肽、蛋白质和酶是由-氨基酸缩合而成的生物高分子。由于某些氮基酸残基含有羟基或碱基，使这些生物高分子成为两性物质。因此，在一定的pH条件下，离子交换树脂能够提取、分离和纯化多肽、蛋白质和酶。蛋白质和酶在强酸或强碱条件下不稳定，强烈的疏水作用也会使其变性，因此所用的树脂应当是亲水的弱酸树脂或弱碱树脂。例如，聚丙烯酸系列的弱酸树脂，以纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶为载体的弱酸或弱碱树

15、脂等均适用于生物高分子的分离与纯化17。应用这些树脂从动物、植物、微生物及其代谢产物中分离纯化天然多肽、蛋白质和酶的研究报道甚多。1.3.6 离子交换树脂法分离纯化核苷酸及核酸核苷酸及脱氧核苷酸为两性化合物，含有可形成阳离子的碱基和可形成阴离子的磷酸基，因此用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂皆可对其进行分离和纯化。离子交换树脂法也是分离纯化寡聚核苷酸和核酸的重要技术。例如，邱蔚然18等用D293离子交换树脂成功地从DNA酶解液中分离纯化出5-脱氧核苷酸。1.3.7 离子交换树脂法分离纯化糖类化合物糖类化合物分子中含有许多醇羟基，只有极弱的酸性，如葡萄糖的离解常数仅6.6x10-3，但在中性水溶液

16、中仍能与强碱性阴离子交换树脂(OH一型)发生离子交换作用而被吸附，并易被10% NaCl水溶液解吸。可惜许多糖类物质在强碱性条件下会发生异构化和分解反应，因而限制了OH一型强碱性阴离子交换树脂在糖类物质分离纯化中的应用。为使糖类物质能用离子交换树脂法分离纯化，人们根据糖中顺式邻二羟基能与硼酸形成复盐阴离子的特性，采用硼酸型阴离子交换树脂或用硼酸溶液作流动相，从而使搪类物质能在阴离子交换树脂上进行分离纯化。钟振声等用此法成功地分离了果糖、半乳糖和葡萄糖19,20。由于离子交换树脂提取分离技术设备简单，操作方便，生产连续化程度高，而且得到的产品往往纯度高，成本低，因而离子交换树脂在天然产物提取分离

17、研究与生产中的应用必将日益广泛。最后值得一提的是极性或弱极性大孔吸附树脂，它们对于非离子性有机化合物的吸附性能颇佳，适用于非离子性天然产物的分离与纯化21。第二章、离子交换大孔吸附树脂吸附分离苦豆子生物碱2.1 实验试剂与仪器2.1.1 主要设备与仪器HZS-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子开发有限公司）；722S可见分光光度计、pHS-3B型酸度计、电子天平、FA1004N分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；铁架台、蝴蝶夹、层析柱、具塞三角瓶、移液管、分液漏斗等。2.1.2 实验材料与试剂CD-180（天津南开大学化工厂）、X-5、CAD-40、D113、D151、D152（安徽三星树脂科技

18、有限公司）六种离子交换大孔吸附树脂；提取液原液（紫金花药业公司提供）；氢氧化钠（天津科密欧化学试剂有限公司）、盐酸（北京化工厂）、氯化钠（西安化学试剂厂）、无水乙醇（烟台双双化工有限公司）、磷酸二氢钾、溴麝香草酚蓝(天津天新精细化工开发中心)、苦参碱(中国药品生物制品检定所)、氯仿（均为分析纯）。2.1.3 树脂的预处理取六种树脂各35mL置入三角瓶中，加入蒸馏水浸泡24h，待其充分溶胀；然后倒掉蒸馏水加入150mL的0.1mol/L 氢氧化钠溶液浸泡2h，再用蒸馏水洗至中性；再用0.1mol/L 的盐酸溶液150mL浸泡2h，后用蒸馏水洗至中性待用。2.2 实验方法2.2.1 标准工作曲线的

19、绘制2.2.1.1 配置缓冲液及酸性染料准确称取磷酸二氢钾1.3609g，氢氧化钠0.3376g分别置于500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度待用；将氢氧化钠溶液和磷酸二氢钾溶液混合，用pH计调pH至7.60即得缓冲溶液，缓冲液放在广口瓶中待用。再准确称取0.0625g溴麝香草酚蓝，加入1000mL缓冲液即得酸性染料，酸性染料放在棕色瓶中待用。2.2.1.2 绘制标准曲线精密称取苦参碱样品0.0051g，置于50mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得苦参碱标准液。分别取标准液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL置于125mL的具塞三角瓶中，挥尽乙醇

20、，加入酸性染料和氯仿各6.00mL，密塞剧烈振摇2min使充分溶解，倒入分液漏斗静置2h后分出氯仿层。以0.00mL的样为空白，在分光光度计上于417nm处分别测定标准液的吸光度，以测得的吸光度为纵坐标，以苦参碱浓度为横坐标绘制标准曲线。2.2.1.3 样品溶液的测定取1.00mL的样品液，用蒸馏水定容至50mL，再取一定量的稀释液加入具塞三角瓶中，加入酸性染料和氯仿各6.00mL，剧烈振荡2min，倒入分液漏斗静置2h后分出氯仿层，取下层提取液在分光光度计上于417nm处测定其吸光度。2.2.2 静态吸附及解吸实验2.2.2.1 静态吸附实验分别取树脂5mL左右放入三角瓶中，然后分别加入50

21、mL的苦豆子生物碱提取液，于25振荡24h（振荡频率110次/min）。以大孔吸附树脂与原液接触时为0时刻，每隔一定时间（0、1、2、4、6、8、12、24h）取样，测定其吸光度，然后由标准曲线算出其浓度。并按下式算出树脂的吸附率：树脂吸附率=（C0-C1）/C0100% （式2-1）式中，C0为吸附前样液中生物碱的浓度，mg/mL；C1为吸附后样液中生物碱的浓度，mg/mL。然后以取样时间为横坐标，以样品的浓度为纵坐标作得静态吸附曲线。2.2.2.2 静态解吸实验将已吸附的苦豆子提取液滤掉，保留树脂。将0.1mol/L氢氧化钠50mL加入树脂中，振荡4h解吸。然后取样测其吸光度再算出浓度，再

22、根据下式计算其解吸率：树脂的解吸率=C2/（C0-C1）100% （式2-2）式中，C2为解吸液中的生物碱浓度，mg/mL；（C0-C1）为树脂吸附的量，mg/mL。最后综合吸附率和解吸率选出最佳的树脂以及该树脂的最佳吸附时间，进行接下来的动态吸附和解吸实验。2.2.3 动态吸附实验2.2.3.1 上柱量对苦豆子生物碱吸附率的影响取4个层析住，各装入选好的树脂30mL左右。然后分别以60mL、120mL、180mL、240mL（即2BV、4BV、6BV、8BV）的苦豆子生物碱提取液上柱，流速应保持一致，成滴不成串。反复上样3、4次后以最佳吸附时间静置，然后取样测定其吸光度，计算各上柱量的吸附率

23、，选出最佳上柱量。吸附完毕，用0.1mol/L氢氧化钠溶液洗树脂，洗至洗脱液无色，浸泡2h。用蒸馏水洗到中性，再用0.1mol/L盐酸溶液浸泡2h，最后用蒸馏水洗至中性待用。2.2.3.2 上柱流速对苦豆子生物碱吸附率的影响以最佳上柱量上柱，使流速分别控制在1BV/h、1.5BV/h、2BV/h，反复上样3、4次后以最佳吸附时间静置，然后取样测定其吸光度，计算各流速的吸附率，选出最佳吸附流速。再用上述方法把树脂再生待用。2.2.3.3 上柱液pH值对苦豆子生物碱吸附率的影响分别以最佳上柱量的pH值为6、8、10、12、14的原液上柱，使流速控制在最佳流速。反复上样3、4次后以最佳吸附时间静置，

24、然后取样测定其吸光度，计算各pH条件下的吸附率，确定最佳上柱pH值。再把树脂再生备用。2.2.4 动态解吸实验2.2.4.1 不同解吸液对苦豆子生物碱解吸率的影响准备3个树脂柱，以最佳吸附条件上柱吸附，然后分别取样测定吸附后的流出液的吸光度，计算吸附量。然后分别用浓度都为0.1mol/L的氢氧化钠溶液、盐酸溶液和氯化钠溶液解吸，解吸流速保持为成滴不成串。从2BV的量开始，每增加2BV取样测定其吸光度（即2BV、4BV、6BV、8BV、10BV），直至解吸液无色为止。计算各点的生物碱浓度，然后以解吸量为横坐标，生物碱浓度为纵坐标作出各个解吸液的解吸曲线。最后根据解吸率选出最佳解吸液。2.2.4.

25、2 解吸液乙醇浓度对苦豆子生物碱解吸率的影响以最佳吸附条件上柱，充分吸附后依次用含乙醇20%、30%、40%、50%、60%（体积比）的解吸液各2BV解吸，在各点处取样测定吸光度然后计算其浓度。以所含乙醇浓度为横坐标，解吸流出液浓度为纵坐标作出解吸曲线。2.2.4.3 解吸流速对苦豆子生物碱解吸率的影响准备3个树脂柱，以最佳吸附条件上柱，充分吸附后依次用含乙醇20%、30%、40%、50%、60%的解吸液各2BV解吸，解吸流速分别为1BV/h、1.5 BV/h、2 BV/h。在各点处取样测定吸光度然后计算其浓度。以所含乙醇浓度为横坐标，解吸液浓度为纵坐标作出解吸曲线，计算各个流速下的解吸率，选

26、出最佳解吸流速。2.3 实验结果2.3.1 标准工作曲线表2-1苦参碱浓度与吸光度的对应关系苦参碱浓度（mg/mL）0.00000.00170.00340.00680.01020.01360.0170吸光度（A）0.0000.1090.2110.3500.5120.6650.780图2-1标准工作曲线由图2-1知，样液中苦参碱的质量与吸光度的线性回归方程式为y=45.597x+0.032 （式2-3）相关系数R=0.9972，在苦参碱浓度为0.0000-0.0170mg/mL的范围内苦参碱浓度与吸光度之间有良好的线性关系。在以下实验中我们以样液中苦参碱的浓度作为其生物碱含量的指标，由式2-3算

27、出样液中的生物碱浓度。2.3.2 静态吸附及解吸实验2.3.2.1 静态吸附实验表2-2静态吸附实验吸附时间（h）各树脂吸附后流出液的浓度C1（mg/mL）D151D152D113CAD-40X-5CD-18009.3379.3379.3379.3379.3379.33715.2274.2064.9516.5866.0184.95125.6494.6214.0997.0313.9993.53945.3034.1343.3367.2846.3445.07565.8163.5502.9796.3156.2725.18985.0043.9062.8377.2427.0855.631125.1463.

28、6062.8807.4567.2426.016244.9323.3212.5947.5847.4705.389图2-2静态吸附曲线表2-3各个树脂的最佳吸附率树脂型号D151D152D113CAD-40X-5CD-180吸附量（mg/mL）4.4056.0166.7433.0225.3385.799吸附率（%）47.1864.4372.2132.3757.1762.102.3.2.2 静态解吸实验表2-4静态解吸实验树脂型号D151D152D113CAD-40X-5CD-180吸附量（mg/mL）4.4056.0166.7431.7531.7673.952解吸量（mg/mL）3.4460.10

29、00.0840.5370.7373.362解吸率（%）78.241.661.2530.6441.6985.07由表2-3和表2-4知树脂CD-180的吸附和解吸效果是最好的，因此我们选CD-180树脂做动态试验，且为使吸附率达到最大，吸附时间应控制在2h左右。2.3.3 动态吸附实验2.3.3.1 上柱量对苦豆子生物碱吸附率的影响吸附前原液的生物碱浓度为C0=3.849mg/mL表2-5上柱量对苦豆子生物碱吸附率的影响上柱量（mg生物碱/mL树脂）吸附后浓度C1（mg/mL）吸附率（%）7.6980.92775.9315.3961.36964.44423.0941.56859.2630.792

30、2.02447.41图2-3上柱量对吸附率的影响由实验结果可知随着上柱量的增加吸附率逐渐降低，因此为使吸附率达到最大，本实验选用上柱量为7.698mg生物碱/mL树脂。2.3.3.2 上柱流速对苦豆子生物碱吸附率的影响吸附前原液的生物碱浓度为C0=3.849mg/mL。表2-6上柱流速对生物碱吸附率的影响流速（BV/h）吸附后浓度C1（mg/mL）吸附率（%）10.23893.821.50.20794.6220.45688.15图2-4上柱流速对生物碱吸附率的影响由图2-4可知流速在1.5BV/h左右时吸附率达到最大，达94.62%。因此最佳吸附流速为1.5BV/h。2.3.3.3 上柱液pH值对苦豆子生物碱吸附率的影响吸附前需把上柱液的pH值调成指定值，加入氢氧化钠溶液调整，需边加边搅拌防止局部被强碱烧坏，不同的pH值所加的氢氧化钠溶液体积不同，因此吸附前需要检测各个pH值原液的吸光度，然后计算出其浓度。表2-7上柱液PH值对苦豆子生物碱吸附率的影响pH值吸附前浓度C0（mg/mL）吸附后浓度C1（mg/mL）吸附率（%）63.4080.91373.2083.0550.72276.38102.7560.12395.54122.5020.03198.77143.2550.03598.92