生物技术生物化学实验讲义18页.docx

1、生物技术生物化学实验讲义18页实验一 糖的呈色反应和还原糖的检验教师范读的是阅读教学中不可缺少的部分，我常采用范读，让幼儿学习、模仿。如领读，我读一句，让幼儿读一句，边读边记；第二通读，我大声读，我大声读，幼儿小声读，边学边仿；第三赏读，我借用录好配朗读磁带，一边放录音，一边幼儿反复倾听，在反复倾听中体验、品味。 一、实验目的要练说，得练听。听是说的前提，听得准确，才有条件正确模仿，才能不断地掌握高一级水平的语言。我在教学中，注意听说结合，训练幼儿听的能力，课堂上，我特别重视教师的语言，我对幼儿说话，注意声音清楚，高低起伏，抑扬有致，富有吸引力，这样能引起幼儿的注意。当我发现有的幼儿不专心听别

2、人发言时，就随时表扬那些静听的幼儿，或是让他重复别人说过的内容，抓住教育时机，要求他们专心听，用心记。平时我还通过各种趣味活动，培养幼儿边听边记，边听边想，边听边说的能力，如听词对词，听词句说意思，听句子辩正误，听故事讲述故事，听谜语猜谜底，听智力故事，动脑筋，出主意，听儿歌上句，接儿歌下句等，这样幼儿学得生动活泼，轻松愉快，既训练了听的能力，强化了记忆，又发展了思维，为说打下了基础。 1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。2.了解鉴定还原糖的方法及其原理。其实,任何一门学科都离不开死记硬背,关键是记忆有技巧,“死记”之后会“活用”。不记住那些基础知识,怎么会向高层次进军?尤其是语文学科涉猎

3、的范围很广,要真正提高学生的写作水平,单靠分析文章的写作技巧是远远不够的,必须从基础知识抓起,每天挤一点时间让学生“死记”名篇佳句、名言警句,以及丰富的词语、新颖的材料等。这样,就会在有限的时间、空间里给学生的脑海里注入无限的内容。日积月累,积少成多,从而收到水滴石穿,绳锯木断的功效。 二、实验原理糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。与一元酚如一萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：通常使用的无机酸为硫酸。如用盐酸，则必须加热

4、。常用的酚类为一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式；（一）糖的呈色反应 1Molish反应(萘酚反应) 本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与一萘酚作用，形成红紫色复合物。在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其

5、他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 2蒽酮反应 糖经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10一酮一9，10一二氢蒽)反应生成蓝一绿色复合物。 3. Seliwanoff反应(间苯二酚反应) 该反应是鉴定酮糖的特殊反应。在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需2030s。在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较慢。只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。 4Bial反应(甲基间苯二酚反应) 戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在下，它与甲基间苯二酚(地衣酚)缩合，形成深蓝色的沉淀物

6、。此沉淀物溶于正丁醇。己糖也能发生反应，但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。（二）还原糖的鉴定含有自由醛基(一CHO)或酮基(C=O)的单糖和二糖为还原糖。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(铜、铋、汞、银等)还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。1Fehling反应 费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。上述反应可用下列方程式表示：在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。由这

7、些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。2. Benedict反应Benedict试剂是Fehling试剂的改良。它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。 3Barfoed反应 该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用

8、。在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10 min内水解而发生反应。还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。三、实验试剂和材料仪器1.测试糖液2阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，1淀粉溶液和2种未知糖液。2.试剂Molish 氏试剂称取萘酚2克，溶于95乙醇中并定容到100ml。注意临用前，新鲜配制，贮于棕色瓶中。蒽酮(Anthrone)试剂 溶解0.2g蒽酮于100mL浓硫酸(A.

9、R，比重1.84，含量95%)中。当日配制、使用。 Fehling氏试剂 试剂A：将34.5g硫酸铜(CuSO45H20)溶于500mI。蒸馏水中。 试剂B：将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，储于带橡皮塞瓶中。临用时，将试剂A和B等量混合。 Benedict氏试剂 溶解85g柠檬酸钠(Na3C6HO，llH20)及50g无水碳酸钠于400mI。水中；另溶8.5g硫酸铜于50mL。热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾人柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀，可过滤本试剂可长期使用。如放置过久，出现沉淀可取用其上清液。 Bial氏试剂 溶解1.5g地衣酚(orcin01)于5

10、00mL，浓盐酸并加2030滴10三氯化铁溶液。Seliwanoff氏试剂 溶解50mg问苯二酚(resorcin01)于100rnl，盐酸(盐酸：水=1:2VV)中。临用前配制。盐酸浓度不宜超过12，否则，它将导致糖形成糠醛或其衍生物。浓硫酸。3.器材试管，试管架，煤气灯和沸水浴等。四、实验方法（一）.糖的呈色反应1Molish反应取8支已标号的试管，分别加入各种测试糖液lmL(约15滴)，再各加入Molish试剂2滴，摇匀。逐一将试管倾斜，分别沿管壁慢慢加入浓硫酸l mL，然后，小心竖直试管，使糖液和硫酸清楚地分为两层，观察交界处颜色变化。如几分钟内无呈色反应，可在热水浴中温热几分钟。记录

11、各管出现的颜色，说明原因，检定未知糖液。2蒽酮反应取8支标号的试管，分别加入lmL蒽酮溶液，再将测试糖液分别滴加到各试管内，混匀，观察颜色变化，鉴定未知糖液。3Seliwanoff反应取试管8支，编号，各加人Seliwanoff试剂ImL。再依次分别加入测试糖液各4滴，混匀，同时放人沸水浴中，比较各管颜色变化及出现颜色的先后顺序，分析说明原因。注意蔗糖的反应。 4. bial反应将2滴测试糖液加到装有1ml Bial试剂的试管中,沸水浴中加热,观察颜色变化.如遇到未知糖呈色不明显,可以3倍体积水稀释,并加入1ml戊醇,摇动,醇液呈蓝色,即为阳性反应。（二）还原糖的鉴定1Fehling反应 取8

12、支试管，各加Fehling试剂A和B各lmL。摇匀后，分别加人测试糖液各4滴，沸水浴煮23min，取出冷却，观察沉淀和颜色的变化。2. Benedict反应 于8支试管中先各加入Benedict试剂2ml,再分别加入测试糖各4滴,沸水浴中煮2-3min,冷却后,观察颜色变化.3.barfoed反应分别加入测试糖液2-3滴到含有1ml Barfoed试剂的试管中,煮沸约3min,放置20min以上,比较各管颜色变化及红色出现的先后顺序.五、注意事项1. Molisch反应非常灵敏，0001葡萄糖和00001蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中。过浓的果糖溶液，由于硫酸对它的

13、焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色。需稀释糖溶液后重做。2.果糖在Seliwanoff。试剂中反应十分迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间长，且只能产生黄色至淡红色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合。生成绿色到蓝色产物。3.酮基本身并没有还原性，只有在变为烯醇式后，才显示还原作用。4.糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。有保护胶体存在时，常生成黄色沉淀。实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒，因而每次观察到颜色可

14、能略有不同。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来区别。5.Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现，它与一般还原性实验不相同，观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程。六、思考题 1列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用。 2应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时，应注意些什么问题? 3举例说明哪些糖属于还原糖。 4运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。5牛乳中含有5双糖。如何证明牛乳中有双糖存在?这种双糖是什么糖?请选用一些颜色反应来加以鉴定。 实验二 3，5二硝基水杨

15、酸比色定糖法一、目的和要求1.掌握 3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。2.掌握分光光度计的使用方法。二、721分光光度计的使用分光分析原理有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert- Beer定律。（一）Lambert定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的

16、浓度(C)不变则液层的厚度(L)愈大，光线强度的减弱也愈显著。若C不变， OD L （二） Beer定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，若液层的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著。若L不变： OD C（三）Lambert-Beer 定律及其应用1Lambert-Beer 定律：当一束单色光通过一均匀溶液时，该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。其关系式如下：两边取对数得：lgT=KCL 图6 一束单色光通过溶液时的情况示意图式中T为透光度，I0为入射光强度，I为透过光的强度，C为溶液的浓度，L为液层的厚度。K为常数，称为消光系数，其数值与物质种类、光线波长和溶

17、液温度有关。 若将 用光密度（OD）表示该溶液对光线吸收的情况（有的也用吸光度A表示），则它们之间的关系如下： 2待测溶液浓度的计算： 根据Lambert-Beer定律 标准溶液：ODs=KsCsLs待测溶液：ODu=KuCuLu当两种溶液的液层厚度相等（Lu = Ls）、温度相同、且波长也相同（相同物质的两种不同浓度）时，则Ku=Ks。Cu= CsODuODsODsODuCsCu=两式相比得：即：721E型分光光度计的操作 这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。其波长范围为360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好。使用方法如下： 1. 转动波长选择钮，选用所需

18、的波长。2. 接通电源（指示灯亮），打开电源开关。3. 将机器预热20分钟。4. 按动“Mode”键，模式转换到“T”模式。5. 拉动比色皿座的拉杆半格，使隔板正好档住光路，按“0T”按钮调0，然后将拉杆推回。6. 按“100T”按钮调节“100T”，此时显示屏出现“BLA”字样，闪烁几秒后出现“100.0”,调节完毕。将比色皿放入，空白对照放入第一格，重复步骤六以后，将模式转化为“A“模式，测定溶液的吸光度。做标准曲线时从低浓度往高浓度过渡时不需要用蒸馏水润洗比色皿。比色完毕后，关上电源开关，取出比色皿，将比色皿暗箱盖好，清洗比色皿并晾干。三、3， 5-二硝基水杨酸比色定糖实验原理糖的测定方

19、法有物理和化学两类。由于化学方法比较准确，常常使用之。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有醛基和酮基的糖类。在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色强度成一定的比例关系，在550nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。操作方法一、葡萄糖标准曲线的制定取6支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：表6 葡萄糖标准曲线的制作管号 项目空白12345标准糖溶液（mL）00.

20、20.40.60.81蒸馏水（mL）10.80.60.40.20DNS(mL)333333 煮沸10分钟，用水冷却加蒸馏水（mL）161616161616吹 吸 均 匀光密度（OD）将上述各管溶液混匀后，在721分光光度计上用550纳米进行比色测定，用空白管溶液调零点。记录光吸收值。以葡萄糖浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制出标准曲线。 二、样品中还原糖含量的测定1.样品中还原糖的提取：准确称取新鲜苹果（去皮）1.0克，加少量蒸馏水于研钵中研磨，加蒸馏水洗研钵并移至大试管，放入50恒温水浴中保温30分钟。保温完毕先用纱布过滤。再用滤纸过滤，移入100mL容量瓶中。将上清液作为还原糖待测液。或直

21、接取适量浓度的未知糖溶液进行测定。2.样品中总糖的水解及提取准确称取1克淀粉放入大试管中，加6mol/L的盐酸10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h后，取出12滴，用碘碘化钾溶液检查水解是否完全，若已完全，则不出现蓝色。水解毕冷却至室温后用6mol/L的NaOH调pH至中性，并定容至100mL，过滤，取滤液10 mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。3.样品中含糖量的测定分别吸取两种待测液各1mL（作平行对照），按标准曲线制作方法精确加入各种试剂，将各管混匀后，测定各管的光密度，两管对照取平均值。4.结果计算在标准曲线上查出相应的还

22、原糖含量，按下述公式计算出样品内还原糖的百分含量。总糖（）100还原糖（）100试剂和器材一 、试剂 1. 3，5-二硝基水杨酸试剂 （又称DNS试剂）： 182g酒石酸钾钠（A.R.）溶于500mL热水中，在热溶液中依次加入3，5一二硝基水杨酸 （C.P.）6.3g，2mol/L的 NaOH溶液 262mL，再加5g结晶苯酚（A.R.）和5g亚硫酸钠（C.P.），搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。2. 碘碘化钾溶液：把20克碘化钾和10克碘溶于100mL水中，使用前，取1mL加水稀释到10mL。3. 0.1%葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯的葡萄糖（预先在1

23、05烘至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，冰箱保存备用。 二、器材（1）试管和试管架。 （2）吸量管（1毫升和2毫升）。 （3）容量瓶（100毫升） （4）恒温水浴锅 （5）721分光光度计讨论 DNS溶液配制的时候为什么要加入氢氧化钠、苯酚等试剂？ DNS反应时为何要过量？实验三 蛋白质和氨基酸的呈色反应一、目的要求(1) 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。(2) 学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。二、原 理蛋白质和氨基酸鉴定常用方法蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。1双缩眠反应 当脲(即尿素)加热至l80时两分子脲缩

24、合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有个CSNH2、一CH2一NH2，一CRHNH2，一CH2一NH2CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOHCH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。2Salkowski(1888)蛋白黄色反应它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，

25、原因在此。硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是：3茚三酮反应 蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外其他氨基酸生成紫红色最终为蓝色化合物。三、器材与试剂器材试管及试管架 水浴锅 量筒 滴管 滤纸片 移液管试剂和材料10NaOH溶液 1CuSO4溶液 0.5苯酚溶液 浓HNO3卵清蛋白溶液（蛋清：水120） 尿素 0.1茚三酮乙醇溶液四、操作步骤1.双缩脲反应（1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。

26、试管冷却后，加入约1毫升10氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。（2）另取一支试管，加卵清蛋白溶液10滴，再加10NaOH溶液10滴及1CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。2. Salkowski(1888)蛋白黄色反应（1）取一支试管，加入卵清蛋白溶液10滴及浓HNO334滴，加热，冷却后再加入10NaOH溶液5滴，观察颜色变化。（2）取一支试管，用0.5苯酚溶液代替蛋白质溶液，重复上述操作，注意黄色的生成及最后变成橙色。（3）剪一些指甲和头发分别放入2支试管中，各加入数滴浓硝酸，观察颜色的变化。3.茚三酮反应 （1）取2支试管分别加入

27、卵清蛋白溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加入0.5ml0.1茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，冷却，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸溶液呈色深浅。（2） 在一块滤纸片上滴加1滴0.5甘氨酸溶液，风干后，加1滴0.1的茚三酮乙醇溶液显色，用电吹风吹开显色。观察出现的紫红色斑点。五、实验记录以“十”和“一”表明阳性、阴性反应，标明颜色并以“”、“”和“”表明颜色深浅程度。六、思考题 ” 1 综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法的特点和用途。2如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。能对此作何结论?3茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是。为什么?4是否所有的氨基酸都

28、呈现黄色反应的阳性结果，为什么?是否大部分蛋白质呈现阳性结果。为什么?实验四 蛋白质浓度测定考马斯亮蓝染色法一、目的要求学习考马斯亮蓝(Coomssie Brilliant B1ue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、原 理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理浓度的快速。灵敏的方法。 考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键(vsn der Waalsbond)结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beerslaw)。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595

29、nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pg时就有0275光吸收值的变化，比lowry法灵短4倍，测定范围为10一1000ug蛋白质，微量测定法测定范围是110ug蛋白质。此反应重复性好精确度高，线性关系好标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究

30、表明：NaCl，KCl，MgC12，乙醇，(N4H)2S04无干扰强碱缓冲剂在测定中有一些颜色于扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100,SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污刑的存在对颜色影响太大而不易消除。三、试剂与器材试剂 1考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G250 100mg溶于50mL95乙醇中，加入100mL 85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01(W/V)考马斯亮蓝G250，4.7(W/V)乙醇，8.5(W/V)磷酸。 2标准蛋白质溶液结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mgmL蛋白溶液。测试样品 未知蛋白质溶液。器材试管、试管架、移液管(5mL)，微量取液器，721型分光光度计四、操作方法标准法制定标准曲线取14支试管分两组按下表平行操作表8 考马斯亮蓝标准曲线制作方法试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.020.030.040.050.060.070.15mol/L NaCl/ml0.10