视黄醇结合蛋白4升高诱导载脂蛋白B产生及其与高甘油三脂血症关联的研究.docx

1、视黄醇结合蛋白4升高诱导载脂蛋白B产生及其与高甘油三脂血症关联的研究视黄醇结合蛋白4升高诱导载脂蛋白B产生及其与高甘油三脂血症关联的研究摘要：背景和目的：据报道，高水平视黄醇结合蛋白4与人类胰岛素抵抗有关联。然而，关于关于血清视黄醇结合蛋白4与代谢表型关联性的大规模人群调查证据依然缺乏。在本研究中，我们旨在评估血清视黄醇结合蛋白4在中国中老年人群中的分布及其与代谢表型之间的关联。设计和对象：本研究样本来源于广州市的一个包含了2780名中国对象的横断面研究，研究对象年龄分布在50-70岁之间，采用酶联免疫吸附法测定血清视黄醇结合蛋白4的浓度。结果：男性视黄醇结合蛋白4浓度的均值为28.04ug/

2、ml，女性为37.76ug/ml。循环血中视黄醇结合蛋白4与血清甘油三酯和载脂蛋白B的浓度呈正相关。在对混杂因素进行多重调整后，与下四分位数的视黄醇结合蛋白4浓度的研究对象相比，处于上四分位数浓度的实验对象发生高甘油三酯血症的优势比显著增大。此外，血清RBP4和空腹血糖，胰岛素水平，平衡状态下胰岛素抵抗指数呈显著相关。而且，我们的研究显示了RBP4加强了微粒体甘油三酯转运蛋白的表达以及活化，通过上调蛋白质二硫化物异构酶，抑制低密度脂蛋白受体的表达，及损伤胰岛素信号通路，诱导载脂蛋白B在体内及体外的分泌。（体内实验及体外实验）结论：循环血中RBP4浓度升高通过诱导富甘油三酯的含载脂蛋白B的脂蛋白

3、，使高甘油三脂血症发病风险增加。肥胖患病率的升高是世界范围内胰岛素抵抗和二型糖尿病的主要危险因素。众所周知，脂肪细胞可以分泌多种脂肪因子，这些脂肪因子被认为加剧了胰岛素抵抗和二型糖尿病相关的代谢障碍。因此，探索危险因素对于代谢性疾病的早期诊断和预防非常重要。RBP4是脂质转运蛋白家族的一员，最初被认为是血液循环中一种转运视黄醇（维生素A）的特殊载体。肝细胞被认为是正常状态下分泌RBP4的主要场所。然而，脂肪组织也分泌相当数量RBP4,并且在胰岛素抵抗的状态下对血清RBP4的水平有突出贡献。作为一种新发现的脂肪因子，RBP4提示与肥胖及肥胖并发症有关联，尤其是胰岛素抵抗，二型糖尿病和代谢综合征中

4、的多种症状。血清RBP4浓度在糖耐量受损和T2DM对象中浓度升高，但在具有T2MD家族史的非糖尿病且胰岛素敏感的对象中浓度降低。人类RBP4转基因小鼠中RBP4过渡表达，或者在正常小鼠体内注入重组的RBP4都可诱导胰岛素抵抗。与此相反，杂合或纯合的RBP4基因敲除小鼠的胰岛素敏感性增高。高甘油三脂血症是胰岛素抵抗及T2DM患者中最常见的脂代谢异常。胰岛素抵抗及胰岛素缺乏造成脂蛋白酶的活性下降，导致极低密度脂蛋白分解速度减慢以及增加肝脏中甘油三脂的产生。我们近期的研究证明了小鼠体内RBP4的干预刺激了固醇调节原件结合蛋白-1C基因的转录活动，并增加了肝脏甘油三酯和极低密度脂蛋白的分泌。然而，关于

5、RBP4和高甘油三脂血症之间关联性的来自大规模人群研究的证据仍然不足。本研究设计采用了横断面研究，调查了RBP4在中国中老年人群中的分布，并探索血清RBP4水平与高甘油三脂血症之间的关联及其内在机制。材料和方法： 研究人群：本研究的人群来自于一个正在进行的研究课题【中国南方老年人群的营养与健康调查】，该研究调查年龄相关性慢性疾病与饮食和遗传因素的关联及其干预措施。从2008年3月到2009年3月，一共有2780位符合条件的参与者加入研究（包括1541名男性和1239名女性），参与者的年龄在50-70岁之间，只有在广州居住满10年以上的居民才会被纳入为对象。本研究中，满足以下一个或者两个条件的参

6、与者将会被排除：1）年龄低于50岁者；2）有肿瘤史、糖尿病史、心血管疾病史或脑卒中病史。本研究草案由中山大学审查委员会审核通过，所有研究对象均签署了书面知情同意书。数据收集：由经过培训的调查人员通过面对面的调查方式，采用标准化的问卷收集基本数据。本问卷调查设计是基于调查人群的6个试点调查。问卷中包含了社会人口因素、健康状况和膳食因素。根据“国际体力活动问卷评分规定”，体力活动分为轻体力活动，中等体力活动和重体力活动。根据研究对象对相关问题的回答，糖尿病和心血管疾病家族史，或者自我报告的心血管疾病可分类为“有”或“无”。 在隔夜空腹10小时以上之后，所有患者都在早上接受检查。人体测量指标包括身高

7、，体重，腰围，臀围。血压由专业内科医师测量。体质指数由体重除以身高的平方得到，根据为中国人制定的标准，将BMI分为正常体重（24.0kg/）,超重（24.0-28.0 kg/），或肥胖（28.0 kg/）。由两名研究人员独立的输入问卷数据，若发现异常则由第三名研究人员进一步核查。血清脂联素和RBP4的测定：通过酶联免疫吸附试验测定血清中脂联素和RBP4的浓度，试剂批内和批间变异系数分别为4.1-5.%和3.7-6.3%。ELISA仪的批内变异系数为3-8%，批间变异系数为4-10%。血清和肝脏载脂蛋白B水平的定量：根据生产使用说明，以纯化的小鼠载脂蛋白B为标准，用ELISA试剂盒测定血清及肝组

8、织中载脂蛋白B的浓度。本方法已被证明对小鼠载脂蛋白B具有高特异性，并且对其他类似物不产生交叉反应。批间和批内变异分别小于10%和12%。统计分析：正态分布的数据可以使用均数标准差来描述，偏锋分布的数据用中位数（四分位数间距）报告，分析之前可以使用对数转换达到近似正态分布。分类变量用频率及百分数描述。对连续型变量使用协方差分析，采用多元logistic回归分析对分类变量进行分析，对不同四分位数的RBP4浓度进行了比较。协方差分析用于比较不同性别的RBP4浓度水平。采用偏相关分析计算RBP4和代谢特征之间的相关系数。采用多重逐步回归分析来检测血清RBP4和其他参数的关联。多元logistic回归用

9、于估计高甘油三脂血症的优势比。潜在的混杂因素包括年龄、性别、吸烟、饮酒、体力活动、受教育水平、自己报告的心血管疾病、糖尿病家族史、C反应蛋白、脂联素、平衡状态下的胰岛素抵抗指数，体质指数、体脂、腰围以及腰臀比都已经在回归模型中得到控制。自然对数转换值在适当的时候用于分析。所有的统计分析都是通过SPSS软件包18.0进行。P0.05为具有统计学意义。参与者的RBP4四分位数特征：尽管血清RBP4浓度的粗均数女性（38.766.82ug/ml）显著高于男性（29.447.15ug/ml），（P0.01），如表1所示，但是不同RBP4浓度四分位数的研究对象在临床和生物化学特征上没有 表现出性别差异。

10、RBP4水平较高的研究对象更可能有自我报告的冠心病（P0.05），更大的腰围（P0.01）和腰臀比（P0.01）。关于代谢参数，上四分位数RBP4浓度的研究对象表现出更高的TG水平（P0.01），低密度脂蛋白胆固醇水平（P0.05）和载脂蛋白B（P0.01）。HOMA-IR也随着RBP4浓度四分位数的增大而逐渐增加（P0.01）。但是，RBP4浓度水平与体质指数及血清脂联素水平没有关联。RBP4和高甘油三脂血症的关联性：在不同的代谢特征当中（表1所示），偏相关系数分析显示了RBP4和甘油三酯之间的强关联性（相关系数=0.51，P0.01）。随着RBP4浓度的升高，高甘油三脂血症发生的优势比升高

11、（P0.001的趋势；表2所示）。在上四分位数的RBP4组中，在调整了年龄、性别、生活方式、自我报告的心血管疾病、糖尿病家族史、收缩压和舒张压之后（模型2），高甘油三脂血症的优势比为4.89（95%置信区间为3.47-6.74）。有意思的是，在进一步调整了C反应蛋白，脂联素和HOMA-IR（模型3）只轻微地减少了高甘油三脂血症的OR值（OR,4.36;95%CI,2.93-5.73）。进一步调整体质指数、腰围和臀围（模型4）（OR,3.92;95%CI，2.93-5.73）。此外，多重逐步回归分析显示血清甘油三酯和血清RBP4相互独立（P0.001，表3所示）。体内实验和体外实验显示RBP4刺

12、激载脂蛋白B的分泌和高甘油三脂血症的发生：为了进一步阐明RBP4促进高甘油三脂血症产生的的机制，我们用HepG2细胞系进行体外实验以及用RBP4转基因小鼠进行体内实验，研究RBP4对载脂蛋白B分泌的效应。与对照组的HepG2细胞系相比较，对HepG2细胞系培养基添加生理剂量的RBP4导致载脂蛋白在细胞水平上的剂量依赖性mRNA增多（图1A），以及蛋白表达增多（图1B）和同等程度增加的载脂蛋白B（图1C）。我们发现RBP4转基因小鼠血浆载脂蛋白B浓度升高（图1D），并且与野生型小鼠相比，常规饮食组与高脂饮食组的转基因小鼠肝脏载脂蛋白的mRNA水平均增高（图1E）。然而，RBP4转基因小鼠的肝组织

13、中蛋白水平轻微且不显著的改变，提示在常规膳食喂养及高脂膳食喂养组中，过度表达RBP4的小鼠的血浆脂质含量升高可能是由于诱导产生的肝脏脂蛋白造成的。在注射泰罗沙白抑制脂酶的小鼠中，与野生型小鼠相比，表达RBP4的小鼠肝脏总甘油三酯分泌率明显升高（图1G）。正如预期，在RBP4转基因小鼠中，普通膳食组及高脂膳食组的小鼠的血清总甘油三酯及低密度脂蛋白水平均显著升高。因此，RBP4能增加富甘油三酯的脂蛋白分泌同时适用于人类及啮齿类动物模型。RBP4通过上调二硫化物异构酶（PDI）加强微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP）的活性： MTP酶是细胞质内质网中的载脂蛋白伴侣，对载脂蛋白B转运脂质非常重要，是细胞内

14、载脂蛋白B降解或稳定的关键调节因子。我们进一步探索RBP4能否在体内实验及体外实验中改变MTP的表达。RBP4干预显著提高了MTP在mRNA水平及蛋白水平的表达（图2A及2B）。考虑到PDI是MTP的组成结构，我们进一步分析了PDI的水平。在HepG2细胞系中，RBP4干预同样升高了PDI的mRNA及蛋白表达，呈浓度依赖模式（图2A、2B）。此外，在RBP4的刺激下，观察到HepG2细胞系中MTP脂转运活动呈现剂量依赖性增强（图2C），首次阐明RBP4直接刺激人类肝细胞中的MTP。 为了进一步在体内实验进行验证，采用普通膳食及高脂膳食喂养C57BL/6J小鼠和RBP4转基因小鼠16周。与野生型

15、小鼠相比，RBP4转基因小鼠的MTP及PDImRNA（图2D）及蛋白(图2E)表达更加明显。此外，RBP4转基因小鼠的MTP活性显著高于其同窝别的非转基因小鼠（图2F）。这些发现提示在外源性RBP4刺激的体外实验以及RBP4转基因小鼠的体内实验中，PDI蛋白表达的增加与MTP活性加强存在关联。RBP4降低低密度脂蛋白的表达及损伤胰岛素信号转导：近期的研究显示低密度脂蛋白受体的缺失导致载脂蛋白B分泌增加及分解减缓。因此，我们在体内实验及体外实验中研究了RBP4过渡表达是否会改变低密度脂蛋白受体的表达。与同窝别非转基因小鼠相比，普通膳食及高脂膳食组的RBP4转基因小鼠均表现出更明显的低密度脂蛋白受

16、体mRNA(图3A)及蛋白质（图3B）表达。HepG2细胞中RBP4的孵化也导致LDLR mRNA(图3C)和蛋白（图3D）的表达剂量依赖性减少。考虑到枯草溶菌素转换酶9（PCSK9）在肝脏低密度脂蛋白受体的降解过程中起到重要的作用，我们检测了RBP4对PCSK9的mRNA水平的效应。体外RBP4的刺激以及小鼠体内RBP4的过度表达均导致PCSK9 Mrna 表达的显著增加。我们进一步研究RBP4对肝细胞核因子1(HNF-1)的效应，该因子是一种已经确定的PCSK9地转录调节因子。正如预期，在RBP4处理的HepG2细胞及RBP4转基因小鼠中均观察到了HNF-1de mRNA水平显著升高。细胞

17、内胰岛素信号通路是肝细胞apoB/VLDL组装以及分解/稳定的另一个重要调节因子。我们的结果提示RBP4 转基因小鼠的肝脏胰岛素信号受损，通过降低蛋白激酶Tyr458的Ser473和PI3Kp85亚基的磷酸化程度而损伤胰岛素信号，常规膳食组合高脂膳食组均出现这样的结局（图3E）。正如预期，在RBP4处理的HepG2细胞同样观察到了类似的胰岛素信号抑制（图3F）。讨论： 近期的研究中，我们报告了RBP4水平和高甘油三脂血症的发生以及胰岛素抵抗之间正相关性的大规模人群证据。此外，这种相关性与生活方式、慢病家族史、心血管疾病、脂联素及体质指数无关。体内及体外实验均显示RBP4的过度表达通过促进富甘油

18、三酯的含载脂蛋白B的脂蛋白分泌，升高血清甘油三酯的浓度，这种效应可能是由MTP活性及LDLR表达表达受抑制和胰岛素信号受损的联合诱导作用产生的。 基于性激素对脂肪细胞表达及分泌有直接作用的观点，我们在调整了混杂因素之后，仍然在研究当中对不同性别的中国中老年研究对象进行了观察。促性腺激素可能是影响RBP4表达的另一个因素，绝经后妇女与绝经前妇女相比，前者血液循环中RBP4浓度较高，年龄超过50岁的妇女血液循环中RBP4浓度高于年龄小于50岁妇女，这两者提示了促性腺激素的可能的作用。作为一种与肥胖及肥胖并发症相关的脂肪因子，已经有大量关于RBP4水平的升高的糖耐量受损对象、T2DM对象及具有T2D

19、M家族史的非糖尿病对象的研究。与这些研究一致，我们的研究阐明了人类血清RBP4浓度与胰岛素抵抗有显著的关联性，提示人类血液循环中的RBP4与外周组织的胰岛素敏感性受损有直接的关联，胰岛素抵抗通过HOMA-IR测定。然而，RBP4水平与胰岛素敏感性之间关联性的研究结果并不一致。在几个研究当中观察到了RBP4水平与胰岛素敏感性之间缺乏关联。RBP4测量方法不同有可能是造成差异的主要原因。使用不同的血浆抗凝方法，免疫分析中使用不同的RBP4抗体明显影响不同个体之间的测量结果。与前人的研究发现一致，肥胖的对象血清RBP4浓度较高，我们的研究观察到了血清RBP4与腰围、腰臀比（不包括BMI）之间有关联性

20、，提示内脏脂肪比身体总脂肪对循环中RBP4浓度贡献更大。肝脏分泌过多的甘油三脂对胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病有突出影响，并导致血脂异常和心血管疾病。高RBP4和高甘油三脂血症之间的关联在多个研究人群中得到报告，包括病理性肥胖的对象及T2DM患者，大部分的研究都是在西方国家展开的。在中国，相关的大规模人群研究仍然缺乏。与近期一个在中国汉族人群开展的研究一致，该研究提示了RBP4变异与高甘油三脂血症的关联，我们的研究揭示了在中国的中老年人群中，RBP4和甘油三酯呈现出强关联性，且随着RBP4水平升高，高甘油三脂血症的OR值增大，进一步证实血清RBP4与甘油三酯代谢异常之间有更大关联。 此外，偏相关分析

21、提示RBP4水平与炎症因子CRP之间有显著的正相关。男性及女性研究对象中，血清CRP水平均随着RBP4四分位数的增大而升高，提示RBP4作为炎症前期的标志，与初级的炎症反应有关，且可能潜在调节慢性炎症的进程。作为VLDL 的固定结构组件，apoB脂蛋白在成熟的VLDL-TG颗粒的组装以及稳定性中发挥重要的作用，该成熟颗粒随后即分泌到外周血液循环中。apoB脂蛋白由肝脏和小肠在餐后分泌，大部分apoB脂蛋白来源于肝脏。我们首次发现RBP4调节的apoB产生和分泌增加同时体现在转录及转录后水平上。我们观察了RBP4干预的HepG2细胞以及RBP4转基因小鼠的apoB蛋白的mRNA水平，发现了以前用

22、传统的apoB刺激因素所没有观察到的现象，如胰岛素。此外，RBP4诱导细胞内apoB以及分泌的apoB蛋白想死程度地升高，提示在RBP4诱导下，apoB蛋白合成并通过分泌通道稳定而持续地分泌，不伴随显著降解。细胞内质网中apoB 伴侣-MTP酶，对载脂蛋白B转运脂质非常重要，并且是细胞内载脂蛋白B降解或稳定的关键调节因子。对肝脏组织细胞内MTP蛋白表达及转运脂质的能力的评估，显示了小鼠RBP4的过渡表达不仅增加了MTP的mRNA和蛋白质表达，也加强了MTP的活性，首次阐明了RBP4直接刺激体内MTP。在HepG2细胞中，对MTP表达及活性的同样的刺激效应在24小时内快速发生，鉴于已报导的MTP

23、的半衰期为4天，提示RBP4导致的如此迅速的效应可能是由于MTP的快速合成。作为MTP的一个亚基，PDI对MTP的正常活性起着关键作用。以往的研究阐明了PDI表达增加提高了MTP的活性。与这个观点一致，我们观察到常规饮食及高脂饮食的RBP4转基因小鼠与同等条件喂养非转基因小鼠相比，PDI表达显著升高。在HepG2细胞中也观察到了剂量依赖性的PDI表达升高。以往的研究报告，老鼠肝细胞及HepG2细胞内新合成的apoB大多数在短期内降解。许多因素都可以影响apoB的稳定性，其中低密度脂蛋白受体可以加速apoB的分泌及减缓其分解。与这个结论一致，我们的结果显示了外源性RBP4干预及体内RBP4过渡表

24、达均导致低密度脂蛋白受体在mRNA水平及蛋白质水平的显著减少，增加了apoB的稳定性。与以往研究的结论一致，HNF-1对PCSK-9的调节起核心作用，是促进肝脏LDLR降解的的主要因子。我们的研究首次显示了HNF-1和PCSK-9显著升高，提示了RBP4可能通过HNF-1-PCSK-9信号通路调节LDLR的降解。此外，RBP4也加强了转录后apoB稳定性及降解的过程。我们以往的研究确定了RBP4刺激SREBP1脂肪酸/TG生物合成通道的目标基因的表达，导致中性脂肪的积聚增加，抑制了apoB的降解和加强了它的稳定性。据研究报告，胰岛素信号通路减少是apoB稳定性的另一个促进因素，其直接或间接加强

25、细胞对脂质的利用，以及诱导MTP表达的增加。我们发现在RBP4干预的HepG2细胞及RBP4转基因小鼠中，PI3K/Akt信号通路包含的关键蛋白均被高度抑制。总而言之，我们的数据揭示了RBP4调节细胞中性脂肪增加的可能机制，胰岛素信号通路受损，MTP活性的刺激，以及LDLR表达的减少共同促进了apoB的分泌和高甘油三脂血症。 据我们了解，这是在国内第一个进行大规模人群研究探讨RBP4水平与高甘油三脂血症和胰岛素抵抗之间关联性的研究。多个潜在的混杂因素得到了控制，这些因素可能会限制残余混杂效应的可能性。此外，我们对RBP4的浓度进行了双重测量，检测在3个月以内结束，以期最大程度减少季节因素对生物标志的影响。然而，因为横断面研究的缺点，我们不能确定RBP4是否为高甘油三脂血症的病因。并且，我们对中国中老年人群的研究结果能否用于推断年轻的人群以及其他民族的人群还有待于验证。总之，我们的研究阐明了RBP4水平升高与高甘油三脂血症具有显著且直接的关联。我们还进一步提供了RBP4在转录及转录后水平上诱导含apoB的脂蛋白分泌的证据。因此，本研究发现提供了一个新的视角，探讨RBP4在胰岛素抵抗及糖尿病相关的高甘油三脂血症发病机制中的作用。