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1、研究生进修课程分子生物学模板核酸分子杂交( nucleicacidhybridization) 指具有一定同源序列的两条核酸单链( DNA或RNA) , 在一定条件下按碱基互补配对原则, 形成异质双链的过程。 利用核酸分子杂交技术, 就能够使用已知序列的单链核酸片段作为探针, 去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 分子杂交基本原理: 具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)碱基互补配对结合, 重新形成双链; 在这一过程中, 核酸分子经历了变性和复性的变化, 以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。 杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂

2、交体系中已知的核酸序列称作探针(probe), 探针一般见于进行核素或非核素示踪标记。用放射性同位素、 生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段, 即为探针( probe) 。探针可用于分子杂交, 杂交后经过放射自显影、 荧光检测或显色技术, 使杂交区带显现出来。 DNA变性的方法: 1.加热, 2.改变DNA溶液的PH, 3.有机溶剂( 如甲醛、 尿素、 甲酰胺及丙酰胺等) 等理化因素。 影响复性( 杂交) 速度的因素: 1、 DNA浓度, 2、 DNA片段的大小, 3、 温度。4、 溶液的离子强度, 5、 DNA顺序的复杂性。 探针的种类极其选择: 基因探针根据标记物不同可粗分为放射性

3、探针和非放射性探针两大类; 根据探针的来源及核酸性质不同又可分为基因组DNA探针, RNA探针, cDNA探针, 及寡核苷酸探针等几类。 指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多, 有细菌、 病毒、 原虫、 真菌、 动物和人类细胞DNA探针。优点: 这类探针多克隆在质粒载体中, 能够无限繁殖, 取之不尽, 制备方法简便。不易降解( 相对RNA而言) , 一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探针的标记方法较成熟, 有多种方法可供选择, 如缺口平移, 随机引物法等, 能用于同位素和非同位素标记。RNA探针是一类很有前途的核酸探针, 早期采用的RNA探针是细胞mR

4、NA探针和病毒RNA探针, 这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的, 标记效率往往不高, 且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的, 而不是用于检测。 分子克隆: 是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组, 将重组分子导入到合适的受体细胞中, 使其在细胞中扩增和繁殖, 以获得DNA分子大量复制, 并使受体细胞获得新得遗传特征的过程 基因工程: 利用分子克隆技术来操作目的基因, 并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工程。 分子克隆的基本过程: 1.分: 得到目的基因2.切: 将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。3.接: 将目的基因和载体连接, 形成重组

5、子。4.转: 将重组子转到适当的宿主细胞中。5.筛: 筛选出含有正确重组子的宿主细胞, 扩增。 工具酶分类1.使核酸降解的核酸酶类: 核酸内切酶、 核酸外切酶。2.催化核酸合成的酶类: DNA聚合酶, RNA聚合酶, 连接酶, 逆转录酶。3.核酸修饰酶类; 甲基化酶, 激酶, 基团转移酶, 磷酸酶等。 型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常见工具酶, 被誉为分子生物学家的手术刀。 能以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为反转录酶(reversetranscriptase, RT), 合成的DNA产物称为互补DNA(complementaryDNA, cDNA)。常见的逆转录酶有禽

6、类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(moMLV)逆转录酶 所谓载体(vecter)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。当前用于基因克隆的载体种类繁多, 包括在大肠杆菌中使用的质粒、 噬菌体载体、 酵母菌质粒载体以及动、 植物病毒载体等 几种常见的DNA分子连接方法: 1粘性末端连接法2平头末端连接法3人工接头法4同源多聚尾序连接法 质粒DNA分子或以质粒为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程称为转化(transformation)。 经过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(

7、transduction)。 转染: 是由转化和感染两个词构成的新词, 指真核细胞主动或被动导入外源DNA的过程。 要使克隆基因在宿主细胞中表示, 就要将它放入带有基因表示所需要的各种组件的载体中, 这种载体就称为表示载体( expressionvector) 。 原核生物基因大多具有操纵子模式, 克隆基因表示需符合其调控特点。原核表示系统常见的强启动子。好的启动子必须具备的两个条件: 一是转录效应强; 二是能够被有效地控制。( 1) Lac启动子, 来自乳糖操纵子(Lacoperon)( 2) PL和PR启动子( 3) trp启动, 来自色氨酸操纵子( 4) Tac启动子( 5) T7噬菌体

8、启动子 2.终止子(terminatorT)在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。 分泌型载体的优点: 一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定; 一些在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性, 分泌可能使蛋白质能够正确折叠; 产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸, 因为切割位点在信号肽与编码序列之间, 甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。缺点: 1.目的蛋白质的产量往往很低, 2.信号肽不能被切除或切在错误位置上等。 真核表示载体至少要含两类序列: 原核质粒的序列在真核宿主细胞中表示重组基因所需要的组件。原核DNA序列: 包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、 能用在细

9、菌中筛选克隆的抗药性基因标志等, 以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、 并复制繁殖得到足够使用的数量。表示重组基因所需要的组件: 包括启动子、 增强子、 转录终止和加poly-A信号序列、 mRNA剪接信号序列、 能在宿主细胞中复制或增殖的序列, 能用在宿主细胞中筛选的标志基因、 以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等 复制(replication)是指遗传物质的传代, 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 DNA复制的基本特点: ( 一) DNA双链的解旋( 二) 复制的方式半保留复制( 三) 复制叉和半不连续复制( 四) 复制的基本过程

10、: 起始、 链的延长、 终止。 当前已知参与松弛螺旋及解链的酶与蛋白质主要有拓扑异构酶、 解链酶及DNA单链结合蛋白。 两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的意义:按半保留复制方式, 子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致, 即子代保留了亲代的全部遗传信息, 体现了遗传的保守性。遗传的保守性, 是物种稳定性的分子基础, 但不是绝正确。 真核生物每个染色体有多个起始点, 是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。 复制中的不连续片段称为冈崎片段(okazakifragment

11、)。 DNA从起始点(origin)向两个方向解链, 形成两个延伸方向相反的复制叉, 称为双向复制。 参与DNA复制的物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP; 聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶, 简写为DNA-pol; 模板(template):解开成单链的DNA母链; 引物(primer):提供3-OH末端使dNTP能够依次聚合; 其它的酶和蛋白质因子。 核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应 聚合反应的特点:DNA新链生成需引物和模板; 新链的延长只可沿53方向进行。 核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶

12、学依据。一) 核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正; 二) 复制的保真性依赖正确的碱基选择 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制: 遵守严格的碱基配对规律; 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能; 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。 解螺旋酶: 拓扑异构酶-能改变DNA空间构像的酶; 改变DNA超螺旋状态、 理顺DNA链。作用: DNA复制时松弛超螺旋, 以利复制叉的行进及DNA合成, 合成后再引向超螺旋。解链酶-复制蛋白rep作用: ATP供能时, 解开DNA双链。单链结合蛋白( SSB) 作用: SSB与解开DNA单链结合, 保护稳定DNA。与新复制单链结合, 以防其降解。

13、 DNA聚合酶, 拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较 提供核糖3-OH 提供5-P 结果DNA聚合酶 引物或延长中的新链 游离dNTP去PPi (dNTP)n+1连接酶 复制中不连续的两条单链 不连续连续链拓扑酶 切断、 整理后的两链 改变拓扑状态 解链酶(helicase)利用ATP供能, 作用于氢键, 使DNA双链解开成为两条单链。解链酶有多种, 包括大肠杆菌解链酶II、 III, 大肠杆菌Rep蛋白等。Rep蛋白又定名为解链蛋白。 DNA拓扑异构酶的作用机制: 拓扑异构酶: 切断DNA双链中一股链, 使DNA解链旋转不致打结; 适当时候封闭切口, DNA变为松弛状态。反应不需

14、ATP。拓扑异构酶: 切断DNA分子两股链, 断端经过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能, 连接断端, DNA分子进入负超螺旋状态。 端粒(telomere): 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒的结构特点: 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、 C碱基的短序列。端粒的功能: 维持染色体的稳定性; 维持DNA复制的完整性 除生殖细胞和少数体细胞外, 绝大多数体细胞无法检测到端粒酶的活性, 而多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。端粒酶活性升高可能引起癌症, 端粒酶表示可能是肿瘤形成发展的共同途径。端粒酶缺乏同样会引起癌症 RNA病毒在细胞内复制成双链

15、DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息, 并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下, 前病毒基因组经过基因重组(recombination), 参加到细胞基因组内, 并随宿主基因一起复制和表示。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合, 都可成为致病的原因。 突变的意义: ( 一) 突变是进化、 分化的分子基础; 二) 只有基因型改变的突变形成DNA的多态性; ( 三) 致死性的突变可导致个体、 细胞的死亡; ( 四) 突变是某些疾病的发病基础 DNA损伤( 突变) 可能造成两种结果: 其一是导致复制或转录障碍( 如胸腺嘧啶二聚体, DNA骨架中产生切口或断裂) ; 其二是导致复制后基因突变( 如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶) , 使DNA序列发生永久性改变。因此, 必须经过进化使细胞拥有灵敏的机制, 以识别和修复这些损伤, 否则细胞无法维持正常代谢。 DNA损伤的修复有多种类型: 光修复, 切除修复, 重组修复, SOS修复 基因是含有生物信息的DNA片段, 根据这些生物信息能够编码具有生物功能的产物, 包括RNA和多肽链。 DNA分子中四种碱基的摩尔百分比具有一定的规律性, 即A=T、 G=C、 A+G=T+C。这一规律被称为Chargaff原则。 B型双螺旋DN