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1、生物化学大学教材生物化学一、生物化学概述(一)生物化学研究的基本内容生物化学是研究生物的化学组成和生命过程中各种化学变化的科学，是研究生命的化学本质的科学。生物化学的研究内容包括以下三个方面：研究生命有机体的化学组成、生物分子，特别是生物大分子的结构、相互关系及其功能。研究细胞中的物质代谢与能量代谢。生物大分子的合成降解及代谢途径的调控细胞中进行的化学过程 。组织和器官机能的生物化学 。 (二)生物化学的发展简史20世纪初，生物化学作为一个独立学科出现。生物化学发展史中，有两个重要的突破。一是1897年发现了酶作为生物催化剂的作用；二是1944发现了核酸作为遗传信息载体的作用。1911 年：F

2、unk 结晶出复合维生素 B，提出“vitamine”一词，现为“vitamin”1926 年：Sunmer 首次将酶（脲酶）结晶，证明了酶的蛋白质本质（1946 年获Nobel 奖）1944 年：Avery 等人通过细菌的转化试验证实DNA 是遗传信息的载体。（未获Nobel 奖）20 世纪 50 年代后生物学进入分子水平。该领域一大批科学家先后获得诺贝尔奖。1953年，Watson和Crick推导出了DNA的三维结构。1958 年（Nobel）：英国化学家 Sanger 测定了胰岛素一级结构。1962 年（Nobel）：英国物理学家 Kendrew（肌红蛋白）Perutz（血红蛋白）解析了

3、蛋白质的三维结构。法国生物学家 Jocob, Monod：遗传信息流（1965）美国生物化学家 Nirenberg：破遗遗传密码（1969）美国生物化学家 Holly： 解析 tRNA结构（1969）1978 年（Nobel）：Mitchell 提出氧化磷酸化的偶联学说“化学渗透学说”英国化学家 Sanger : DNA测序（1983）1989 年（Nobel）：Cech & Altman 分别发现了 ribozyme。等等其他重要事件我国科学家在生物化学领域所作的突出工作：1965年，我国首次人工合成了结晶牛胰岛素。1973年：X-射线分析出猪胰岛素空间结构1983 年：结合有机合成和酶促合

4、成，实现了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合合成 （tRNAAla）1981年又成功合成了酵母丙氨酰tRNA。1999 年：参与人类基因组测序计划（1%）2000年我国生物化学工作者出色地完成了人类基因组计划中1%的测序工作，为世界人类基因组计划的完成贡献了力量。2002年，我国的生物化学工作者又率先完成了水稻的基因组精细图，为水稻的育种和防病奠定基因基础二、蛋白质化学(一)蛋白质的概念与生物学意义1、概念：蛋白质是由氨基酸残基以肽键相连组成的不分支的长链生物大分子。2、意义：蛋白质是构成生物体的基本成分，占细胞干重的 50%。蛋白质是生命过程的执行者，种类繁多，表现出丰富的功能。蛋白质在生物体

5、的生命活动中起着极其重要的作用，已知的生物功能没有一个是离开蛋白质而实现的，生物个体间表现出的差异是由于其体内蛋白质的贡献。1. 生物体的组成成分-结构蛋白,胶原蛋白2. 酶-生物催化剂3. 运输-血红蛋白,肌红蛋白4. 运动-肌球蛋白,肌动蛋白5. 抗体-免疫球蛋白6. 干扰素7. 遗传信息的控制8. 细胞膜的通透性9. 高等动物的记忆、识别机构3、按形状可将蛋白质分为：纤维状蛋白质：多为结构蛋白。球状蛋白质具有广泛的生物学功能。如酶、蛋白类激素等。4、按结构和功能可将蛋白质分为：简单蛋白：仅有蛋白质组成的、结构简单的蛋白质。结合蛋白：在蛋白质分子中除了含有氨基酸成分外，还要有其他的成分的存

6、在，才能保证蛋白质的正常生物活性的蛋白质。 即包含蛋白质和非蛋白质两部分，其中非蛋白部分通常称为辅基。蛋白质中N的平均含量约16%。每克样品中所含蛋白质的克数= 每克样品中的含氮量（克） 6.25(二)氨基酸1氨基酸的基本结构和性质（1）氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到碳原子（C），同时结合到（C）上的是H原子和各种侧链（R基）。氨基酸是蛋白质分子的基本组成单位。构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-氨基酸。20种常见氨基酸中的三个特殊氨基酸Gly不具有手性C原子； Pro为亚氨基酸、Cys中的巯基可与另

7、一个Cys的巯基形成二硫键。（2). 氨基酸的性质光吸收特性：各种氨基酸在可见区都没有光吸收Tyr, Phe, Trp 因苯环上含共轭双键，在紫外光区芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收波长分别为279、278、259nm ）氨基酸的两性解离氨基酸的等电点：对某一种氨基酸而言，当溶液在某一个特定的pH，氨基酸以两性离子的形式存在，并且其所带的正电荷数与负电荷数相等，即净电荷为零。在直流电场中，它既不向正极，也不向负极移动。此时溶液的pH称为这种氨基酸的等电点（pI）。氨基酸的等电点计算1.侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均

8、值：pI = (pK1 + pK2)/2 2.对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸： pI = (pK1 + pK3 )/2 3.对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。碱性氨基酸： pI= (pK2 + pK3 )/2 pH pI时，AA带负电，电场中向正极移动pH pI时，带正电， 向负移动pH pI时，不带电， 不移动在一定pHX围中，溶液的pH离aa等电点愈远，aa带净电荷愈多。化学反应：茚三酮反应：反应试剂茚三酮，氨基酸参与反应基团-NH2，-COOH产物蓝紫色复合物产物颜色蓝紫色；Ru

9、hemann 氏紫反应黄色Sanger反应：2,4-二硝基氟苯 DNFB -NH2侧链基团中的氨基、巯基、酚基2,4-二硝基苯基氨基酸 DNP-氨基酸 黄色Edman反应：苯异硫氰酸酯PITC -NH2PTH-氨基酸 无色2、根据R基团极性对构成蛋白质的20种氨基酸进行分类R基为疏水性或非极性的氨基酸、R基为极性不带电荷的氨基酸、R基为带电荷的氨基酸（包括带正电荷和负电荷的氨基酸）（1）极性氨基酸：1）不带电： Gly、 Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg (碱性氨基酸)3）带负电：Asp、Glu (酸性氨基酸)（2）非极性氨基酸：Ala、Val

10、、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp3、构成蛋白质的20种氨基酸的三字符(三)蛋白质的结构与功能1肽的概念及理化性质肽：一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸分子的-氨基发生酰化反应，脱去一分子水形成肽键，也称为酰胺键。肽就是氨基酸通过肽键连接起来的线性聚合物。天然活性肽：自然界中还存在着大量的肽类，具有各种特殊的生理活性统称为天然活性肽。肽键：蛋白质分子中，由前一个氨基酸的-COOH和后一个氨基酸的-NH2脱水缩合而成的酰胺键，是蛋白质结构中的主价键。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。氨基酸分子在参与形成肽键之后，由于脱水而结构不完整，称为氨基酸残

11、基。每条多肽链都有两端：即自由氨基端(N端)与自由羧基端(C端)，肽链的方向是N端C端。肽平面：肽链主链的肽键C-N具有双键的性质， 因而不能自由的旋转，使连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上，此平面称为肽平面，又称酰胺平面二面角：肽平面的连接处为碳原子。它与相邻的两个参与肽键形成的C和N原子之间的单键可以在一定X围内转动，C-N之间称角，在C-C之间称角，这就是-碳原子上的一对二面角。这对二面角决定了相邻肽平面的相对位置。谷胱甘肽、内啡肽的生理作用，谷胱甘肽的结构特点。2蛋白质的初级结构蛋白质的一级结构是指多肽链上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，包含了蛋白质结构的全部信息。蛋白质的一级结构

12、由遗传信息决定，其一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。 3蛋白质的高级结构(二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构)（1）非共价键 氢键离子键 X德瓦尔力疏水作用（2） S-S键（1). 蛋白质的二级结构：指多肽链主链在一级结构的基础上进一步的盘旋或折叠，形成的周期性构象，维系二级结构的力是氢键。多肽链主链构象的空间限制来自两个方面：1). 肽键不能自由旋转带来的构象限制。肽链中的肽键主要为反式。2). -C 二面角、虽然可以任意旋转，但不是任意二面角所决定的构象都是立体化学所允许的。二级结构的类型：螺旋结构、折叠、-转角和无规卷曲

13、的结构特点及参数。-螺旋 在角蛋白中最常见的构象，为右手螺旋。每圈螺旋3.6个氨基酸残基。侧链基团R在螺旋外侧。主链内部形成H-键，不涉及侧链R。典型的-螺旋是3.613螺旋，一周螺旋3.6个氨基酸，跨越13个原子。（2)超二级结构：在蛋白质中经常存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成有规则的二级结构集合体，充当更高层次结构的构件，超二级结构又称基序或模体（3)结构域：在较大的蛋白质分子里，一条长的多肽链，在超二级结构的基础上，往往组装成几个相对独立的球状区域，彼此分开，以松散的单条肽链相连。这种相对独立的球状区域，称为结构域。（4)三级结构：指一条多肽链在二级结构（超二级结构

14、及结构域）的基础上，进一步盘绕、折叠而成的具有特定肽链走向的紧密球状结构, 或者说三级结构是指多肽链中所有原子和基团在三维空间的排布。 三级结构是指蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，但是不包括亚基间或不同分子间的空间排列关系。三级结构的特点: 1. 整个分子紧密、结实2. 常含有结构域3.许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。肌红蛋白（Mb）是由153个氨基酸残基组成的单一多肽链的蛋白质，含8个 螺旋（A、B、C、D、E、F、G、H），其辅基为血红素。三级结构的稳定主要靠非共价键作用(氢键、离子键、疏水键、X德华力) 此外还有二硫键。（5). 四级结构：多个具有三级结构的

15、多肽链的聚合。或者说四级结构指亚基的种类、数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的相互作用。亚基：有的蛋白质分子由两条以上的肽链通过非共价键相连聚合而成，每条多肽链称为一个亚基。 结构特点：1.分子具有对称性；2.亚基间以非共价键缔合四级结构的稳定主要靠是疏水作用力，另外还有离子键、氢键、X德华引力等 6). 纤维状蛋白质的结构：胶原蛋白：含有较多的羟基脯氨酸（Hyp）、羟基赖氨酸（Hly），多肽链一级结构96%遵守(Gly-X-Y)n。x多为Pro；y多为Hyp或Hly。三股左手螺旋形成的右手超螺旋。角蛋白：-角蛋白和-角蛋白-角蛋白：二聚体结构的中央是由两个右手螺旋的多肽链复绕成左

16、手超螺旋棒状结构。通常含有较多的二硫键。丝心蛋白及角蛋白：一种独特的-折叠片垛叠而成。每个折叠股的主要结构类型是由Gly-Ala/Ser交替形成的长链。研究蛋白质立体结构的方法(一) X-射线衍射技术（二）核磁共振 4蛋白质的结构与功能的关系一级结构与功能的关系，氨基酸组成变化改变其功能。一级结构是空间结构的基础，一级结构决定高级结构。蛋白质的天然结构具有特定空间构象，是其执行特定功能所必需的。通过具体例子说明结构与功能的关系：一级结构与功能的关系：一级结构的变异与分子病。（同源蛋白）一级结构的序列比较。基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降或丧失，就会产生疾病，这种病称为

17、分子病。空间结构与功能的关系：核糖核酸酶的变性与复性实验；血红蛋白与肌红蛋白的功能比较，血红蛋白的别构效应。同功能蛋白质结构的种属差异与保守性：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质为同源蛋白质。通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲缘关系和进化，亲缘关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。说明:生物功能是由一级结构决定的;蛋白质一级结构中保守氨基酸对蛋白质的生物功能致关重要.蛋白质前体的激活切除C肽段后胰岛素原转变为活性的胰岛素血红蛋白的变构与输氧功能 变构作用是指对于多亚基的蛋白质或酶，效应剂作用于某个亚基，引发其构象改变，继而引起其他亚基构象的改变，导致蛋白质或酶

18、的生物活性的变化。 这样的效应剂也称变构剂。蛋白质中氨基酸的修饰 ：这些氨基酸没有遗传密码，是在蛋白质合成后通过有关酶的催化形成的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。 (四)蛋白质的理化性质 1蛋白质的相对分子质量（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE 变性电泳在巯基乙醇存在下， 蛋白质亚基分开，多肽链伸展；然后SDS与多肽链以1.4:1的重量比结合成复合物。SDS与蛋白质的结合改变了蛋白质分子的带电情况和分子形状。因此当蛋白质在电场中移动时，其迁移率仅与其分子量有关。蛋白质分子量M与迁移率 的关系式 Log M = a - b 用已知

19、分子量的标准蛋白在同样条件下电泳，分别测其迁移率，做成标准曲线。测出未知蛋白质的迁移率，从图上查得蛋白质分子量。SDS-PAGE测定蛋白质分子量的特点：蛋白质已变性；对多亚基蛋白，测定的是亚基的分子量。(二)凝胶过滤：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分分开的目的。三）沉降速度法利用超速离心机测定蛋白质分子量和分离纯化蛋白质的方法。蛋白质在离心力作用

20、下发生沉降，沉降速度与蛋白质分子分子量、密度、形状有关。对特定蛋白质来讲，单位离心力场的沉降速度为一定值，称为沉降系数。沉降系数通常用Svedberg 单位（S）表示。一个S等于10-13秒。沉降系数越大分子量越大。层析法又称为色谱技术，为分离纯化生物大分子的重要技术之一，包括离子交换层析、亲和层析等，其中离子交换层析应用最广。离子交换层析基本原理:是依赖于共存于一个系统中的固定相和流动相之间的相互作用实现混合物中各个组分的分离。 2蛋白质的两性电离及等电点可解离基团：N-端的-NH2、C-端的-COOH以及侧链基团R。蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳定的两大因素。脱

21、水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。酸性氨基酸pI7,碱性氨基酸pI 7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性aa较多,其pI偏碱;如从雄性鱼类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多,其pI 约为12,若含酸性aa较多,则pI偏酸。蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。蛋白质等电点性质为电泳分离的依据. 3蛋白质的胶体性质要形成稳定的胶体分散系统，需要保证三个条件：（1）分散相质点大小介于1100nm。（2）分散相质点带有同种电荷，同种电荷相互排斥，使得质点不易沉淀下来

22、；（3）溶剂在分散相质点表面形成溶剂化层，使分散质点间不易靠拢聚集成较大的颗粒而沉淀。蛋白质溶液是胶体溶液。蛋白质胶体系统稳定的原因：水化层、双电层。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。中性盐、有机溶剂可以破坏蛋白质胶粒的水化膜，引起沉淀1盐析：大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素，使得蛋白质溶解度降低而沉淀析出的现象。各种蛋白

23、质盐析时需盐浓度及pH不同。盐析作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使得蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子和水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度提高，利用不同蛋白质盐溶液的要求不同达到分离纯化蛋白质的目的2. 透析透析常用于蛋白质溶液的除盐，通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。3. 超滤在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤常用于蛋白

24、质溶液的除盐、浓缩 4蛋白质的紫外吸收特征由于蛋白质中含有Trp、Tyr和Phe残基，使蛋白质在近紫外区280nm有最大特征吸收峰可作蛋白质定量测定。通过测定蛋白质溶液的A280nm可以测定蛋白质浓度。 5蛋白质的变性及复性当受到某些因素影响时，维系天然构象的次级键被破坏，蛋白质失去天然构象，导致生物活性丧失及相关物理、化学性质的改变，这个过程称为蛋白质变性。蛋白质的变性复性实验可以用于蛋白质的折叠研究、说明空间结构与功能的关系。变性是指一些理化因素，如热、光、机械力、酸碱、有机溶剂、重金属离子、变性剂（如尿素等），破坏了维持蛋白质空间构象的非共价作用力，导致其生物活性的丧失。变性一般并不引起

25、肽键的断裂，但溶解度降低，可能凝固和沉淀。变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不汲及一级结构的破坏。变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固均变性并不溶解。变性后的蛋白质在除去变性因素后，重新恢复天然构象和生物活性的过程称为蛋白质的复性。蛋白质变性后的特征生物活性：丧失分子结构：有序紧密变无序松散理化性质：溶解度降低，黏度增加， 扩散系数降低等生化性质：易被蛋白酶水解变性机理:热变性（往往是不可逆的）多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。酸碱变性：破坏了盐链。有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。变性后的蛋白质在除去变性因素后，重新恢复天然构象和生物活性的过程称为蛋白

26、质的复性6、蛋白质的呈色反应茚三酮反应。蓝色常用于氨基酸的定性或定量分析。双缩脲反应。肽键与双缩脲试剂反应呈紫色。氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度与2、4-二硝基氟苯反应黄色可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.亦称Sanger反应与苯异硫氰酸酯反应可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.亦称Edman反应与丹磺酰氯反应可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸7、电泳蛋白质是两性解离物质，在偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，通电时带电荷的蛋白质粒子在电场中向带相反方向的电极移动，这种移动现象叫电泳。在一定的电场和介质中，蛋白质迁移速度与蛋白质分子量、所带电荷及分子形状有关

27、。根据蛋白质在低于或高于等电点溶液中带电并在电场中向一级移动原理来分离蛋白质。 最常用的电泳法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳、火箭免疫电泳和高效毛细管电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）丙烯酰胺 和 交联试剂（甲叉双丙烯酰胺）在过硫酸铵催化下聚合而成。可以控制孔径大小8、蛋白质的沉淀（1）加中性盐沉淀蛋白质向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 （2）加有机溶剂沉淀蛋白质、破坏水化膜，降低介电常数（3）加重金属盐沉淀蛋白质、pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+. Pb2

28、+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀（4）加生物碱试剂沉淀蛋白质、pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。(五)蛋白质的分离与纯化实质：蛋白与非蛋白分开，蛋白质之间分开原理1. 溶解度差异 PEG沉淀法、 有机溶剂沉淀法 、 等电点沉淀法2. 热稳定性差异热处理沉淀法、 铜锌SOD（65、15分钟、稳定）3. 电荷性质差异 离子交换层析法、 泳法4. 分子大小和形状差异 凝胶过滤、超滤法 、透析法、离心法5. 亲和力的差异和层析法 (某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合（1）材料来源、来源方便、含量丰富、容易提取、 防止变性（2）分离的一般原则利用分子大小，

29、如分子筛凝胶过滤；利用电离性质，如电泳；利用溶解性，如等电点；利用生物学特性，如亲和层析等（3）纯化鉴定；氨基酸组成分析、末段分析、色谱分析、电泳分析、等电聚焦分析、免疫化学分析（4）序列测定；确定肽链的氨基酸组成、末端和S-S键数目，专一地酶解大的多肽成为较小的片段，蛋白质序列仪，应用肽段序列重叠法确定氨基酸的排序，确定S-S键的位置1蛋白质的抽提原理及方法分离纯化的一般程序可分为：前处理、粗分级和细分级分离三个步骤。(1) 前处理步骤：将欲分离纯化的目的蛋白质从细胞中溶解出来。胞外蛋白质可以直接用缓冲液提取，胞内蛋白质的提取涉及破碎细胞等步骤，再通过离心除去大的细胞碎片等，得到上清液即为可

30、溶性总蛋白溶液。(2) 粗分级：这个阶段主要是除去大量的杂质和杂蛋白。一般采用的方法有中性盐或有机溶剂的分级沉淀的方法，以及超滤等浓缩的方法。(3) 细分级：对目的蛋白质进一步的提纯。通常采用各种柱层析的方法，如：离子交换层析、凝胶过滤层析、吸附层析、疏水相互作用层析、反相层析等，还可以采用制备性电泳的方法。这一阶段常常同时进行生物活性的检测和纯度的鉴定。 2蛋白质分离与纯化的主要方法：电泳、层析和离心蛋白质等大分子具有两性解离性质，在溶液中也会带上不同的电荷，置于电场中也会发生电泳现象，因此可以通过电泳对蛋白质进行分离。层析技术主要有凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析及亲和层析，应掌握这些技术的

31、原理。离心法分离蛋白质等大分子是基于它们的密度差异。当颗粒的密度大于溶液密度时，颗粒就会在溶液中下沉。蛋白质是两性解离物质，在偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，通电时带电荷的蛋白质粒子在电场中向带相反方向的电极移动，这种移动现象叫电泳最常用的电泳法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳、火箭免疫电泳和高效毛细管电泳。基础生化的实验中，重点掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤柱层析（分子筛柱层析）的原理及基本操纵步骤。常用的分离纯化蛋白质的方法主要有：盐析、丙酮沉淀、透析、电泳、离子交换层析、分子筛层析、 超速离心等方法。盐析是应用中性盐加入蛋白质溶液，破坏蛋白质的水化膜，中和了电荷，使蛋白质聚集 而沉淀析出。丙酮沉淀是向蛋白质溶液中加入丙酮使蛋白质沉淀。透析法是利用仅能通透小分子化合物的半透膜，使大分子蛋白质和小分子化合物分离，达到浓缩蛋白质或除去小分子化合物目的。电泳法是根 据蛋白质在一定 pH溶液中可带电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向移动。由于蛋白质的质量和电荷量不同，在电场中的