植物分子生物学实验技术.docx

1、植物分子生物学实验技术植物分子生物学实验技术班 级：研122班专 业：作物生物技术姓 名：陕建国学 号：20122419授课教师：李红英老师实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论一、提取植物DNA和RNA的用处提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。（一）提取植物DNA的用处DNA的提取在植物基因工程以和植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处提取RNA 可以进行 North

2、ern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以和 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析和基因克隆等分子生物学研究的基础。 二、植物组织DNA的提取方法提取植物DNA的试验原理：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中，利用这一性质就可

3、以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。（一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验试剂：1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用0.2

4、mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2、10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3、1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4、0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6 氯仿异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8

5、、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在7080的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9、1molL HCl。10、0.2mol/L NaOH。11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液浓乙醛：H2O1：50（VV）。12. 1.0mol/L 高酸溶液（HClO4）。13、高氯酸溶液。14、0.05mol/L NaOH。15、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/L

6、 NaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml 1mol/L HClO4，混合冷却后用0.5mol/L HClO4定容至刻度，则得100g/ml 的标准溶液。实验步骤 ：1、 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2、 将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3、 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质和下层的氯仿。4、 将试管置72水

7、浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L 高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液4：1（VV），使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5、 再次加入等体积氯仿异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。6、 用滴管吸95的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7、 然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8、 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9、

8、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5070g/ml，并在37水浴中保温30min，以除去RNA。10、 加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质和所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11、 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。（二）植物DNA的CTAB提取法：（来自You are so late的新浪空间）试验步骤：1、 称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。2、 将粉末转移到加有7ml经预热的15CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65水浴中，温育30min。3、 取出离心

9、管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。4、 将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。5、 转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。6、 加入1.5-2ml的1mol/L NaCl和5l RNase置于56水浴中过夜。7、 待DNA完全溶解后，加2-3ml 4预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗3

10、0min。8、 离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。9、 将风干的DNA直接在4保存备用或溶于100l TE溶液中于-20保存. （三）植物叶片的提取步骤（来自b04a43e2bbfcd1e1a002dc21）实验步骤1、在50ml带盖离心管（放在-20度预冷）中加入20ml提取缓冲液I，60水浴预热。2、水稻幼苗或叶子510g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60水浴保温3060分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。3、加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静

11、止510分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。4、室温下5000rpm离心5分钟。5、仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6、在1.5ml eppendorf 管中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。7、如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8、将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。9、加入5lRNaseA（

12、10g/l）,37 10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。10、加入1/10体积的3mol/L NaAc 和2体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。11、用玻璃捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。12、将DNA重新溶解于1 ml TE中，20贮存。三、植物RNA的提取植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体和小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA和叶绿体RNA

13、。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占15。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以和在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3末端都具有20200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。 植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不

14、需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。 内源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。 外源

15、RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2HsOCOOCOOCxH5)，它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂和器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2 和C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水和其它溶液的灭活一般使用0.050.1DEPC，37处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.

16、22m 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。 提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入3 H202溶液中，室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。 尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。这

17、是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。 影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量和产量。人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解

18、离和氧化；或用巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。（一）小麦叶片和不同时期种子的RNA的提取（赵双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法 山东大学生命科学学院,济南）1、取510g材料放入研钵中，加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（在研磨过程中，保证材料始终浸在液氮中，研磨约30min左右）。2、待液氮自然挥发干净后，将材料转入100ml的离心管中，加入68倍体积的裂解缓冲液，轻轻搅拌后，0冰浴20min。3、12000r/min，4离心15min。4、取上清液，加1/3体积的3mol/L醋酸钠（pH 5.3），1/5体积的氯仿-异戊醇（24:1)，轻轻混匀，0冰浴20mi

19、n（加5倍体积裂解缓冲液溶解沉淀以提取DNA)。5、12000r/min，4离心15min。6、取上清，加入等体积冰浴冷却的异丙醇，混匀且冰浴10min。7、5000r/min，4离心10min。将沉淀溶于5ml含有0.1%的SDS缓冲液中，加入8mil/L LiCl使终浓度至2.5mol/L，冰浴4过夜。8、12000r/min，4离心10min。9、70%乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥10min后，溶于DE-PC处理的TE或水中。加入1/10体积10%重复第四、六步进一步除去蛋白质。-70冰箱保存。裂解缓冲液成分：7mol/L尿素，50mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L

20、 Na2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris饱和酚pH8.0,0.1% SDS+0.1%LDS。裂解缓冲液成分：7mol/L尿素，50mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L Na2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris饱和酚pH8.0,0.1% SDS+1%LDS。（二）植物总RNA的提取（XX文库）Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离

21、后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。Trizol试剂配制苯酚饱和液（38%）-380ml/l 、硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 、硫氰酸铵（0.4M）- 76.12g 、醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 、甘油 50ml ，加水至1L实验试剂1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、氯仿:异戊醇 24 : 1 （v/v) 、氯仿。4、异丙醇、无水乙

22、醇、70乙醇。5、Trizol试剂。操作步骤1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装0.1克样品；.每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置分钟、 10000r/min离心10分钟、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000r/min离心10分钟。、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4下r/min离心5分钟。、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，

23、注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70（三）CTAB方法提取植物叶片RNA（XX文库）操作步骤1、取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。 2、每管加入10ml65预热的CTAB提取液和500l -巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65水浴温育30min。 3、每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4，12000rpm离心10min。 4、取上清，加入13体积的8M LiCl和500l -巯基乙醇，-20沉淀过夜。 5、4，12000rp

24、m离心20min。 6、弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120l -巯基乙醇和880l 2M Na Ac (pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）， 涡旋混匀，冰浴5min。4，12000rpm离心10min。 7、取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4，12000rpm离心10min。 8、取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4，12000rpm离心10min。 9、取上清，加入110体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20放置过夜。 10、4，140

25、00rpm离心20min。弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次，每次洗涤后，14000rpm离心10min，弃上清。冰上干燥RNA沉淀。 11、加入100l RNase-free-ddH2O溶解沉淀。取10l稀释200倍检测UV 230、260、280下的OD值，检测RNA样品的纯度与浓度。取5g进行RNA样品的电泳检测，以检测rRNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于70下保存。（四）硅藻土 - 苯酚法（一种广泛适用的 RNA 提取方法）（来自李晓宇的方法）利用硅藻土能够有效吸附 RNA 酶的特性，结合高盐、PVP 和乙二醇丁醚沉淀等过程，建立了高效高质量 RNA 提取方法. 该方

26、法适应性广，可以从富含 RNase 和多糖、多酚等代谢产物提取 RNA 困难的动、植物和微生物材料中提取高质量总 RNA植物组织RNA提取的难点和对策。具体步骤：（全过程均在冰上操作，保持样品温度在 04）1、样品液氮速冻，于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管；2、按照4 ml/g 的比例加入硅藻土提取缓冲液，充分震荡后加入 1/2 体积的水饱和酚和 1/2 体积的氯仿异戊醇(241)，震荡混匀；3、412 000g离心 10 min，取上清加入等体积 5 mol/L KAc(pH 4.8)，混匀后冰浴10 min；4、413 000g 离心 10 min，液相转入新管，重复上述酚仿抽提，

27、直至界面清亮；5、上清移入新管，加入等体积乙二醇丁醚，混合均匀后，冰上放置 1 h；6、414 000 g 离心 15 min，沉淀用 75%乙醇洗 2 次，空气干燥后用适量 DEPC-H2O 溶解，- 70保存。硅藻土提取缓冲液：20 mmol/L 柠檬酸钠(pH 7.0)， 10 mmol/L EDTA， 0.5% SDS，1% - 巯基乙醇，100 mmol/L NaCl，1.9 g/L 处理过的硅藻土。(121高压灭菌 20 min，冷却后再加入 1% - 巯基乙醇，4保存) 。硅 藻 土 的 处 理 ： 5g硅藻土用 50 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)溶

28、解，于 100放置5 min。室温2500g离心5min。弃上清，沉淀用40 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重悬。重复离心和重悬的步骤两次。 超声 1 min。室温3500g离心15min.。沉淀用30ml 50mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重悬。4储存。实验二：PCR 和QPCR普通的PCR是进行定性分析的，而QPCR是进行定量分析的，是检测初始量的，并且在进行PCR是标准曲线的制作是非常重要的。一、PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点

29、，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。（一）PCR的原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR技术的基本

30、原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。（二）PCR反应体系（XX文库）10扩增缓冲液10l4种dNTP混合物200l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100 l1、无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。2、Mg2 :终浓度为1.52.0mmol/L，其对应dNTP为200 mol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由

31、于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。其浓度越小，酶的特异性就越高。3、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。4、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。5、Taq酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7580，一般用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。6、模板：不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情