家蚕Nd裸蛹发生机制的初步研究.docx

1、家蚕Nd裸蛹发生机制的初步研究学校代码： 10289 分类号： S881.2+4 家蚕Nd裸蛹发生机制的初步研究 杨晓博 江苏科技大学密 级： 公开 学 号： 072300007 江苏科技大学硕 士 学 位 论 文家蚕Nd裸蛹发生机制的初步研究 研究生姓名 杨晓博 导师姓名 李木旺 汪生鹏 申请学位类别 理学硕士 学位授予单位 江 苏 科 技 大 学 学科专业 生物化学与 分子生物学 论文提交日期 2010 年 4 月14日 研究方向 家蚕分子遗传学 论文答辩日期 2010 年 5 月 22 日 答辩委员会主席 评 阅 人 2010 年 4 月 14 日分类号： S881.2+4 密 级： 公

2、开 学 号： 072300007 理学硕士学位论文家蚕Nd裸蛹发生机制的初步研究学生姓名杨晓博指导教师李木旺 副研究员汪生鹏 副研究员江苏科技大学二O一O年五月A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master of ScienceStudy on the Mechanism of Naked Pupa Submitted byYang XiaoboSupervised byDr. Li Muwang Dr. Wang Shengpeng Jiangsu University of Scie

3、nce and TechnologyMay, 2010论 文 独 创 性 声 明本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得江苏科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名： 日 期：学 位 论 文 使 用 授 权 声 明江苏科技大学有权保存本人所送交的学位论文的复印件和电子文稿，可以将学位论文的全部或部分上网公布，有权向国家有关部门或机构送交并授权其保存、上

4、网公布本学位论文的复印件或电子文稿。本人电子文稿的内容和纸质论文的内容一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。研究生签名： 导师签名：日 期： 日 期：摘要家蚕裸蛹是自然突变产生的，裸蛹(Nd)基因与丝素重链基因(Fib-H)同位于第25染色体上，二者紧密连锁。早期的研究结果认为Nd裸蛹的形成主要是发生在转录水平，但其分子机制尚不清楚。对Nd基因进行定位，在此基础上对其进行克隆，研究裸蛹发生的分子机制，不仅可以为开发利用家蚕生物资源，构建新型的家蚕生物反应器打下基础，而且对揭示蚕丝蛋白表达分泌的分子机制提供重要的理论依据。本论文首先利用家蚕雌性不交换的特点，以家蚕正常茧品种P50

5、和裸蛹品种Nd为亲本获得P50(P50Nd)和(P50Nd)P50回交群体（分别记为BC1M和BC1F），再用已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对Nd基因进行定位，共筛选出7个与Nd基因连锁的SSR标记。利用另一个群体BC1M构建了Nd基因的遗传连锁图，连锁图的遗传距离为96.8cM，Nd基因位于60.8cM。同时得到了2个与Nd 紧密连锁的SSR标记，S2511及S2513，与Nd基因的距离分别为0.1cM和1.1cM。在KaikoBlast数据库中搜寻基因组序列信息，经过软件分析这些序列信息可知，Nd基因与丝素重链Fib-H基因共同位于Bm_scaf32中，其中S2513与Fib-H基因

6、3端的距离大约为159 kb，引物S2511和S2513之间的距离大约为900 kb，这段距离对于Nd 基因的定位克隆来说还是太大，这些数据为以后Nd基因的精细定位及克隆奠定了基础。其次，采用Real-time RT-PCR方法，对3种丝素基因在5龄第5天正常家蚕54A和Nd品种家蚕的后部丝腺中的表达量进行了定量分析。结果表明，与54A相比较，在Nd裸蛹的后部丝腺中，fib-H基因在mRNA的表达量被极大地下调，约为正常蚕的1/70左右，而fib-L基因和P25基因的表达量分别是正常蚕的1/10和1/6左右。为了进一步探明原因，我们对3种已知的调控蚕丝基因的反式因子的表达水平进行了定量分析。结

7、果表明，在5龄第5天的Nd裸蛹后部丝腺中，POU-M1转录因子的表达水平远远低于正常家蚕中的表达水平，约为正常蚕54A的1/280，而SGF-1和FMBP-1的表达水平分别约为正常蚕的1/2.48和1/8.44。因此，Nd家蚕中丝素基因不能正常表达可能与反式激活因子POU-M1的表达量不足有关。关键词：家蚕；裸蛹基因Nd；SSR定位；实时定量PCR；发生机制Abstract Naked pupa (Nd) of the silkworm Bombyx mori is originated from a natural mutation. The naked Nd gene and the fi

8、broin heavy (H)-chain gene (Fib-H) had been found to be located at the 25th chromosome and closely linked. The early research results showed that the reason of naked pupa may be caused mainly at transcriptional level，but the molecular mechanism is still unclear. Mapping of Nd gene and studying on th

9、e occurring mechanism of Nd，not only good for the exploitation and utilization of silkworm resources and build a new type of silkworm bioreactor, but also can reveal the mechanism of silk protein expressed and secreted. These results can provide an important theoretical basis for silkworm silk too.O

10、wing to a lack of crossing over in females, P50, a silkworm strain that spins normal cocoons, and Nd, a strain with naked pupae, were used as parents to obtain backcross populations P50(P50Nd) and (P50Nd)P50, designated as BC1M and BC1F respectively. Subsequently, mapping of Nd gene was conducted us

11、ing the constructed simple sequence repeat (SSR) molecular marker linkage maps, and 7 SSR markers were found to be linked with Nd gene. By utilizing another BC1M population, we constructed a genetic linkage map for the Nd gene. The genetic distance of this map is of 96.8 cM with the Nd gene located

12、at 60.8 cM. Meanwhile, 2 closely linked SSR markers, namely S2513 and S2511 which is 0.1 cM and 1.1 cM away from the Nd gene respectively were obtained. We analyzed the genome sequences from Kaikoblast database using the software. From the result we found that the Nd gene and fib-H gene are both in

13、the Bm_scaf32，and the distance between Nd gene and the 3 of fib-H gene is about 159Kb; the distance between S2511 and S2513 is approximately 900Kb，but the distance is too long to clone Nd gene. Secondly, we analyzed the expression of three fibroin genes at the fifth day of fifth instar of 54A and Nd

14、 using quantitative real-time PCR method. From the results we found that the expression of fib-H in posterior silk gland of Nd silkworm at transcriptional level was greatly down regulated, it is about the 1/70 level of normal silkworm, while the expression of fib-L gene and P25 gene is 1/10 and 1/6

15、of that of normal silkworm. In order to verify the reason of it, we analyzed the expression of 3 silk gene controlling transcriptional factors using quantitative real-time PCR method. From the result we found that the expression level of POU-M1 in posterior silk gland of Nd silkworm is lower than in

16、 the normal silkworms. But the expression level of the other two factors SGF-1 and FMBP-1 is 1/2.48 and 1/8.44 of normal silkworms. Thus, the fibroin genes abnormally expression is related to the deficient expression of POU-M1. Keywords: Bombyx mori; naked pupa gene (Nd); SSR map; real-time PCR; occ

17、urring mechanismCatalogue注释表英文缩写 英文名称 中文名称A3 actin 3 肌动蛋白3AFLP amplification fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性APS ammonium peroxydisulfate 过硫酸铵ASG anterior silk gland 前部丝腺Fib-H fibroin heavy chain 丝素重链蛋白Fib-L fibroin light chain 丝素轻链蛋白GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 甘油醛三磷酸脱氢酶基因kD

18、 kilo Dalton 千道尔顿min minute 分钟Nd naked pupa 裸蛹MSG middle silk gland 中部丝腺OD optical density 吸光值PSG posterior silk gland 后部丝腺RAPD random amplified polymorphic DNA 随机扩增的DNA多态性 RFLP restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性rpm revolutions per minute 转/分SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠SNP sin

19、gle nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性SSR simple sequence repeat 简单重复序列TEMED NNNN-tetramethylethyl 四甲基乙二胺第1 章 绪 论1.1 家蚕蚕丝蛋白及相关基因1.1.1 家蚕蚕丝蛋白家蚕（Bombyx mori）是一种具有强大泌丝能力的昆虫。其分泌的蚕丝蛋白主要是由丝素蛋白和丝胶蛋白组成。丝素蛋白又包括丝素重链（fib-H）、丝素轻链（fib-L）和Fhx/P25(fibrohexamerin)P25三种蛋白。丝胶蛋白是一类富含丝氨酸的蛋白，包裹在丝素的表面，约占茧层质量的25%，对丝素起到保护和胶粘作

20、用。蚕丝的两种蛋白主要是由丝腺分泌的，从形态和功能上分为前部、中部和后部丝腺，其中前部丝腺没有合成和分泌的作用，是丝物质流经的导管；中部丝腺是整个丝腺中最粗大的部分，其合成分泌的丝胶蛋白占蚕丝蛋白总量的20-25；后部丝腺是合成分泌丝素蛋白的场所，丝素蛋白占蚕丝总量的75-801。丝素蛋白的三种成分fib-H（350 kD）、fib-L（26 kD）和P25的摩尔比为6：6：1。丝素重链与丝素轻链之间由二硫键连接，形成H-L复合体，该二硫键是由重链羧基端的第20个半胱氨酸（Cys-c20）与轻链羧基端第172个半胱氨酸（Cys-c172）形成，重链羧基端的其他两个半胱氨酸（Cys-c1和Cys

21、-c4）形成分子内二硫键2,3形成复合体H-L；P25蛋白与H-L复合体以二硫键与丝蛋白H链连接，以非共价键与L链结合,对丝物质的结构稳定性起到关键作用。P25蛋白是一种糖蛋白，其N端的寡糖链主要是维持H-L复合体结构的完整性。P25蛋白与H-L复合体的结合对丝素蛋白在内质网中的转运和高效分泌分泌起重要的作用4,5,6。通过对不同裸蛹突变品种Nd(2)、Nd-s和Nd-sD的研究表明，由H-L复合体的形成对及其与P25亚基的结合对丝素蛋白的高效分泌非常重要，任何一个亚基缺损都会造成蚕丝分泌量的显著降低4,7,8。1.1.2 家蚕蚕丝蛋白基因家蚕茧丝中的丝素蛋白和丝胶蛋白，包括重链(heavy

22、chain)、轻链(1ight chain)和P25蛋白和丝胶蛋白，由家蚕基因组中的丝素基因在后部丝腺细胞中特异性地合成，丝素基因主要在PSG中表达，家蚕丝素基因在蚕食桑期表达，而在眠中处于关闭状态，此前转录的mRNA也被降解，直至五龄丝素基因的表达达到峰值。丝胶基因-1（Ser-1），是许多丝胶基因中的一个，Ser-1基因是丝胶蛋白的主要表达基因，主要在的MSG后部区域表达；在3龄期与4龄期转录作用很微弱，四眠中没有表达，5龄期又重新开始表达,并在5龄后期转录活性达到一个高水平。家蚕丝素基因和丝胶基因在表达过程中呈现出来的这种组织细胞特异性和发育阶段特异性，使其成为研究真核生物基因表达与调控

23、的理想模型9,10。 重链基因(fib-H)位于第25染色体上，在基因组中以单拷贝形式存在，整个基因长约17kb，外显子（大小分别为67bp，15750bp）和一个内含子（大小为971bp）。其编码区中心高度重复、富含GC（约45%），两侧是非重复的5和3端。基因5末端区（-119-7）是AT富含区（约75%），-30-24区含有5-TATAAAA-3序列，为基本启动子；CAAT boxes位于-93-85间，上游区（-234-66）和下游区（+156+454）有类似增强子的作用，可以增强转录11,12,13,14。轻链基因（fib-L）位于第14染色体上，全长为14,626 bp，成熟mRN

24、A长约1.2 kb，含有7个外显子，第1外显子内前部4lbp的区域为非编码区。第1内含子长达8145 bp，占整个基因长度的60.5，其内部有较多的重复序列存在15。丝素轻链基因与重链基因的5侧翼序列具有很强的同源性。此外，两个基因的上游区还存在着大量完全相同的810 bp的短片段，这些片段中约1/5含有TAAT或TAAAT序列。P25基因（fhx）在家蚕基因组中为单拷贝基因，该基因全长3485bp，包括5个外显子和4个内含子，成熟的mRNA为1173bp。该基因5侧翼区-32-29为TATA-box，-90-87为CAAT box。P25基因的5侧翼区与重链基因的5侧翼区具有高度的相似性，其

25、中P25的-138-49区与重链基因的-230-142区相似性很高16,17。目前已克隆和部分测序的丝胶蛋白基因有Ser-1、Ser-2、MSGS-3、MSGS-4和MSGS-5，这些基因均在中部丝腺特异表达18。其中Ser-1基因是丝胶蛋白的主要表达基因，Ser-l基因全长24kb，在基因组中为单一拷贝，共由9个外显子和8个内含子构成。5-TATAAAA-3位于-30-24间，与重链基因中的TATA box位置相同，CAAAT序列位于-90-86间，与重链基因和P25基因的CAAT序列位置相近。Ser-1基因中的-131-91、-200-171分别与重链基因的-138-98、-209-179

26、具有较高的相似性。Ser-1基因的-331-51间序列在转录中具有类似增强子的作用。家蚕丝素基因的表达调控与其他真核生物一样都是有顺式作用元件和反式作用因子的相互结合在转录水平上进行调控。有关的研究发现丝素轻链基因、P25蛋白基因、Ser基因的5侧翼区与丝素重链基因的5侧翼区均有高度的相似性，这些基因的5侧翼区主要是转录调控区，包括核心启动子、上游元件，增强子等顺式作用元件，这些相似的调控序列推测在其之间存在相似的调控元件以及相似的反式作用因子。至今已经鉴定了多种调控蚕丝蛋白基因表达的顺式元件和可能的反式因子，但由于受研究方法和手段的限制，许多推定的反式因子的编码序列至今仍未完成，目前只获得了

27、FMBP-1、POU-M1和BmFkh(SGF-1) 三种反式因子的cDNA编码序列19,20。1.2 家蚕裸蛹突变体家蚕裸蛹Naked Pupa (Nd)是自然突变产生的，目前已经报道的家蚕裸蛹突变主要有5种，Nd、Nd(2)、Nd-H（桥本裸蛹）、Nd-s（丝胶茧）和Nd-sD。其中Nd、Nd(2)、Nd-H是和丝素重链连锁，裸蛹基因(Nd)与丝素重链基因(Fib-H)同处于第25染色体上），并且与丝素重链基因(Fib-H)紧密连锁21,22,23；而Nd-s（丝胶茧）和Nd-sD，和丝素轻链连锁，同处于第l4染色体24。Nd-s和Nd-sD两突变体后部丝腺发育不完全，但中部丝腺正常。Nd

28、-s和Nd-sD的蛹体由一层薄薄的茧包裹，其成分主要是丝胶，丝素蛋白含量不到正常茧的0.3%25。Nd-sD的分子机制已经基本搞清，是由于丝素轻链基因几个外显子缺损，造成部分基因发生移码，突变产生的丝素轻连C端不含有Cys，无法与丝素重链亚基形成二聚体24,25,26，丝素蛋白的高级结构无法形成，丝素蛋白无法分泌，分泌到茧壳中的基本上都是丝胶蛋白。该机制已经成功用转基因的方法进行了验证，当导入一份正常的丝素轻链基因后，Nd-sD的泌丝功能可以被部分恢复6。最近的研究结果表明，fib-L基因的第三个内含子保守的，这些保守序列中有一段41bp长的序列，该序列在Nd-s突变体中是多拷贝的，同时发现这

29、个片段的内在折叠弯曲在Nd-s突变体中被破坏了，由此可以推断这个弯曲可能介导fib-L基因中第三个内含子的的剪接与重组功能27。Nd裸蛹表现为显性性状。Nd突变体后部丝腺不能分泌丝素蛋白形成正常的茧形，一般只能裸露化蛹；Nd(2)突变体的后部丝腺较短，发育不完全，长度仅及正常蚕的五分之一，几乎不分泌丝素蛋白，中部丝腺与正常蚕一样，并且中部丝腺能够正常分泌丝胶蛋白。早期的研究结果认为Nd 裸蛹性状的形成主要是发生在转录水平，Nd和Nd(2)两变异基因均能在转录水平上抑制重链mRNA的合成，相比之下，Nd(2)基因的抑制能力更强，但其具体分子机制尚不清楚26。Nd(2)突变个体可能与重链结构异常有

30、关，推测其原因：一是与轻链形成二硫键的半胱氨酸的基因发生缺失或重排，二是丝素重链发生构象变化从而干扰了与轻链的结合23。Nd裸蛹的发生机制尚不明确，需要进一步研究。1.3 Gene Location of silkworm基因定位是用一定的方法将基因确定到染色体的实际位置。基因定位,不仅有助于形态标记基因的精细定位和克隆,同时将加快家蚕分子育种的研究进程。主要的方法有体细胞杂交法，克隆嵌板法，原位杂交和荧光原位杂交，连锁分析等。由于受各方面因素的影响，前面的体细胞杂交、克隆嵌板法，在家蚕基因定位中的应用很少。连锁分析（Linkage analysis）：基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈

31、直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点，通过基因型分析（genotyping），经数学分析而将基因定位到遗传图的相对位置上。其原理是生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在着两个相邻的基因座位，距离较远，发生交换的机会较多，则出现基因重组的个体较多；反之，若两者较近，重组机会较少，出现基因重组的个体也较少。重组DNA和分子克隆技术的出现，发现了许多遗传标记，利用某个拟定位的基因是否与某个遗传标记存在连锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体的一定部位，使经典连锁方法获得新的延伸和广阔用途。虽然此方法只能将基因定位到相对位置而无法定位到染色体的绝对位置上，但如果遗传图的标记密度足够大，并结合相应的基因组信息和物理图谱，也能够将基因精确定位并进行克隆。家蚕的大部分基因是通过连锁分析的方法定位到染色体上的28,29。1.3.1 遗传标记及形态学标记定位 遗传标记，是指那些能表达生物的变异性，且能稳定遗传，可被检测的性状或物质，一般包括形态学标记、细胞学标记、生化标记、免疫学标记和分子标记等。目前，家蚕中已经获得定位的基因包括了卵形、卵色、卵壳色、蚁色、体色、斑纹、茧形、茧色、蛹形、蛹体色、蛾体色、蛾体形、蛾斑