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1、发酵工艺学doc发酵工艺学 发酵工艺概论 发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料，生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学，化学工程，基因工程，细胞工程，机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。 现代发酵工程不但生产酒精类饮料，醋酸和面包，而且生产各种食品添加剂：谷氨酸，柠檬酸，苹果酸，核苷酸，多糖等；医疗保健药物如胰岛素，干扰素，生长激素，抗生素和疫苗；农用生产资料：天然杀虫剂，细菌肥料，微生物除草剂；在化学工业上生产AA，酶，维生素和单细胞蛋白等。 Use of microorganisms： 适应性强 消化能力强 繁殖能力强 1857年，法国化

2、学家，微生物学家巴斯德提出了著名的发酵理论“一切发酵工程都是微生物作用的结果”。巴斯德认为：酿酒是发酵，是微生物在起作用。酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟。可用加热的方法来杀死有害微生物，也可将纯种微生物分离出，获得所需发酵产品。 一、发酵工程（fermentation engineering）1直接利用微生物的机能将物料加工以提供产品的过程，又称微生物工程。 在最适发酵条件下，大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。2发酵工业简介Fermentation Industry发酵食品 Fermented Foods有机酸 Organic Acids氨基酸 Amino Acids核酸类物质 Nu

3、cleotides酶制剂 Enzymes医药工业（抗生素） Pharmaceutical (Antibiotics)饲料工业（单细胞蛋白) Feedstuff (eg. SCP)环境工程（废物处理） Environmental Application (Waste Treatment)其它 （冶金工业） Others (eg. Metallurgical industry)二、微生物（一）为什么要利用微生物？微生物繁殖非常迅速微生物培养易于控制微生物本身也容易改造（二）抗生素、氨基酸、酶制剂等产品为什么能通过微生物发酵来生产？这与微生物的生长和代谢特点有什么关系？1、某些微生物因争夺生存环境或

4、营养物，会产生抗生素将其他种类的微生物杀死。2、微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营养物质水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡萄糖 。3、微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需的一些物质，包括氨基酸、核苷酸等。三、Fermentation engineering1发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程上游工程 FERMENTATION Process Control 下游工程UPSTREAM PROCESSES DOWNSTREAM PROCESSES- genetics, cell - product extraction, purification&

5、assay- inoculum development - waste treatment -media formulation -by product recovery-sterilization- inoculation2获得发酵产品的条件适宜的微生物保证或控制微生物进行代谢的各种条件进行微生物发酵的设备精制成产品的方法和设备Use of Microorganisms：Positive（益处）-Biomass-Production-ConversionNegative（危害）-Pathogens-Spoilage3发酵的定义传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象

6、，或者是指酒的生产过程。Fermentation最初来自拉丁语“发泡”（fervere）生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。或更严格地说：发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。工业上的发酵：泛指利用微生物生产某些产品的过程。产品有细胞代谢产物，菌体细胞，酶等。 包括：1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。四、发酵工业简史1.天然发酵阶段：sauce, pickled vegetables, cheese, dough fe

7、rmentation2.纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。3.通气搅拌技术的建立：青霉素的生产 深层培养。4.代谢控制发酵：Glu和Lys生产。5.开拓原料时期：石油发酵，醋酸生产谷氨酸6.基因工程阶段：将不同来源的DNA进行体外重组，转入受体细胞进行繁殖和遗传，达到定向改变生物性状的目的。时间 发酵阶段 主要产品 主要技术-1900 天然发酵 酒 醋 干酪 酵母 天然分批1905- 纯培养 酒精 丙酮丁醇 密闭纯培养1940- 通气搅拌 抗生素 有机酸 通气搅拌 酶 维生素 分批或连续1957- 代谢控制 氨基酸 核苷酸 选育缺陷菌株1960- 开拓原料 单细胞蛋

8、白 连续发酵1979- 基因工程菌 胰岛素 干扰素 DNA 重组纯培养:第一个转折点 通气搅拌:第二个转折点 代谢控制：第三个转折点 基因工程菌：第四个转折点 History of applied microbiologyAncient times-flavour (bread, soy sauce)-brewing (beer, wine) 1861 Louis Pasteur-first phase industrial biotechnology1940 penicillin (Fleming)-antibiotic industry-production of fine chemica

9、ls原始发展阶段（发酵技术开始于家庭小制作，技术进步缓慢，完全是经验式的，并不知道其中的原理。） 传统发酵工业阶段（人们开始了解发酵现象的本质，采用开放式的发酵方式，生产过程及设备较为简单，规模一般不大。）现代发酵工业阶段（技术要求高、发展速度快；生产规模大；菌种生产能力大幅度提高，新产品、新技术、新设备的应用达到前所未有的程度。）生物技术产业阶段 （利用构建的基因工程菌生产。）五、生物反应的过程：实质是利用生物催化剂从事生物技术产品的生产过程。 Cell enzyme biocatalyst monitor sterlized air product bioreactor extract b

10、y product residue sterilizing medium 空气 保藏菌种 碳源、氮源、无机盐等营养物质 空气净化处理 斜面活化 扩大培养种子罐 灭菌主发酵产物分离纯化成品菌种筛选 选摇瓶试验 发酵罐试验发酵工程的概念和内容菌种选育：自然界筛选、诱变育种、基因工程、细胞工程培养基配制：根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方 灭菌：杀灭杂菌扩大培养和接种发酵过程（中心阶段）：检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等分离纯化：菌体：过滤、沉淀代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换四部分组成1菌种选育及扩大培养：生物催化剂的制备，筛选到高产，稳产，培养基要求不太苛刻的菌

11、种。2原料预处理及培养基的制备：淀粉制糖，糖蜜原料3发酵设备及反应条件的选择：生物催化剂是酶：酶反应过程生物催化剂是生物细胞：发酵过程两种发酵方式（根据对氧的需要分）：厌氧alcohol, beer, acetone, butanol, lactic acid, amino acid好氧需大量的氧，通入无菌空气。氨基酸，抗生素（antibiotic）根据培养基物理性状分：固体和液体根据微生物生长特性分：分批和连续 4产品的分离与纯化：是从发酵液中提取符合质量指标的制品。即根据产品类型，特点选择合适的下游技术（downstream processing）的组合。六、微生物工业产品的类型1微生物菌

12、体的发酵以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵工业。传统的菌体发酵工业：面包酵母发酵微生物菌体蛋白（单细胞蛋白）现代的菌体发酵工业：药用真菌（如冬虫夏草，灵芝与天麻共生的密环菌）农业上生防治剂：苏云金杆菌（t）,蜡状芽孢杆菌，细胞中的伴孢晶体可以杀灭鳞翅目和双翅目害虫；丝状真菌的白僵菌，绿僵菌可以防治松毛虫；木霉菌可以防治生物病害。另外，活性乳酸菌制剂，用以改善人体肠道微环境，也是一种菌体的直接利用。还有人畜防治疾病用的疫苗等。2. 微生物酶发酵酶普遍存在于动物，植物和微生物中。酶的最初来源是从动植物组织中提取。但目前应用的酶大多来自微生物发酵。如在食品工业中，用微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生

13、产葡萄糖，氨基酰化酶用于拆分氨基酸。 目前应用的酶大多来自微生物发酵。3. 微生物代谢产物发酵：以微生物代谢产物作为产品是发酵工业中种类最多，也是最重要的部分。这类产品可分为两类：(1)初级代谢产物(primary metabolite) 菌体生长繁殖所必需的，在对数生长期产生的物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质等。许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性。(2)次级代谢产物(secondary metabolite)与菌体生长繁殖无明显关系，是在菌体生长的稳定期（静止期）合成的具有特定功能的产物。如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子、色素等。也把初级代谢物的非生物量的积累看成是次级代谢物。如

14、微生物发酵产生的维生素，柠檬酸，谷氨酸。初级代谢产物和次级代谢产物的异同： 4. 微生物的生物转化利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有价值的产物。最古老的生物转化：利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。另外还有：异丙醇丙醇葡萄糖葡萄糖酸山梨醇山梨糖最显著的特点是特异性强，包括反应特异性，结构位置特异性和立体特异性。由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应。5. 微生物特殊机能的利用利用微生物消除环境污染保持生态平衡等湿法冶金（金属的浸沥回收）利用基因工程菌株开拓发酵工业新领域第一章 菌种选育第一节 工业常用微生物及要求一、常见微生物（一） 细菌（bacter

15、ia）发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）芽孢杆菌属（Bacillus）:-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸（二）放线菌（actinomyces） 属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素小单孢菌属（Micromonospora）：庆

16、大霉素（三）霉菌（mould）亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1. 曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸 米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲 黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素米曲霉和黄曲霉均为半知菌。2. 青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点 桔青霉（P. citrinum）：产生5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。3. 根霉属（Rhizopus ）接合菌 米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chi

17、nensis） 酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。4. 红曲霉属（Monascus）淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。（四）酵母（yeast）单细胞真核微生物，低等真菌。酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。毕赤酵母属（Pichia）产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。（五）其它微生物1.担子菌（basidiomycetes）即菇类

18、（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健食品和饲料。 从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的2035倍。（六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是：体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。烈性噬菌体引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和

19、噬菌体的细菌称溶原性细菌。噬菌体危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。二、微生物工业对菌种的要求1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.易控制培养条件，发酵周期较短。3.抗杂菌和噬菌体的能力强。4.菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。第二节 工业微生物菌种的选育在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。但发酵工业需要培养微生物使其积累大量的代谢产物。所以要采取种种措施打破菌的正常代谢，积累所需要的代谢产物。如青霉素的原始菌种产黄色素，经菌种选育，可使产生菌不再分泌黄色素。土霉素产生菌产生大量泡沫，经诱变处理改变遗传特

20、性可使泡沫减少，节省大量消泡剂。菌种经诱变获得抗phage的特性。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。一、自然选育：从自然界分离获得菌种，根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种从自然界分离获得菌种1. 采样：取地面515 cm的土壤。2. 增殖培养：(富集培养enrichment) 提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。 方法： （1）控制培养基的营养成分：如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖。 （2）控制培养条件：细菌，放线菌：pH7.07.5 3537霉菌，酵母菌：pH 4.56.0 2028 （3）抑制不需要的菌类分离细菌

21、：加入丙酸钠以抑制霉菌，酵母分离厌氧菌：焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧3. 纯种分离（1）划线法：简单、快速。 （2）稀释法：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的几率大，适合分离具有蔓延性的微生物。 固体培养基四区划法接种法步骤一接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤二轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤三以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。 步骤四更换一个新的无菌营养平板 步骤五将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区 。步骤六重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤七由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。步骤八重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二

22、区中划出第三区，如右上图。 步骤九重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。步骤十在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。固体培养基的稀释涂抹接种法【目的】用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目。需要使用的仪器震荡机 吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。 从最后稀释

23、菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧） 使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。 4.生产性能的测定：纯种分离后得到菌株数量大，不可能一一进行性能测试。一般采用两步法：初筛，复筛。从而获得较好菌株（野生型菌株）（区别于变异菌株）。初筛：以量为主复筛：以质为主从自发突变体中获得菌株微生物可遗传的特性发生变化称变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。但自发突变的频率较低，往

24、往不能符合工业生产的要求。因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。是当前菌种选育的一种主要方法。因为人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，速度快，方法简便。但诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合。所以诱变育种的主要环节是：（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液诱变（2）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株筛选诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂：物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍1. 诱变育种的程序选择出发菌株(parent strain)制备菌悬液前培养(添加嘌呤，嘧啶或酵母膏提高变异率)诱变(物理诱变，

25、化学诱变)变异菌株的分离和筛选2. 突变株的筛选：摇瓶筛选法：挑单菌落接斜面接摇瓶 测生产能力琼脂块筛选法：打孔器取出培养，置鉴定平板测发酵产量。随机筛选：传统方法，但要耗费大量的人力物力。近年来，随着遗传学，生物化学知识的积累，人们对于代谢途径，代谢调控机制了解得更多，所以筛选方法逐渐转向理化性筛选。理化性筛选：介绍初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控机理，氨基酸、核苷酸合成途径中普遍存在反馈阻遏和反馈抑制。这对于生产菌本身是有意义的，可以避免合成过多的代谢物而造成的浪费。但在工业中，需要生产菌产生大量的氨基酸，核苷酸等产物。所以要打破微生物原有的反馈调节系统。方法降低终产物浓度a. 筛

26、选终产物营养缺陷型 获得缺少第三个酶的突变株，需供给E才生长。限量供给E，可打破反馈调节，产生大量C。b. 筛选细胞膜透性改变的突变株使终产物排出细胞，以降低细胞内终产物浓度，避免终产物反馈调节。如：用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的生物素营养缺陷型（biotin deficiency）进行谷氨酸发酵。生物素：是B族维生素的一种。又称维生素H或辅酶R。生物素是合成脂肪酸所必需的。因为脂肪酸的生物合成是： 利用糖代谢中间产物乙酰CoA（直接原料是丙二酸单酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（多酶复合体，辅基为生物素）催化下合成。脂肪酸甘油磷酸磷脂蛋白质 生物膜因此，

27、脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的渗透性发生变化，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外的发酵液中。如果使用油酸缺陷型菌株或甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在体外大量积累。筛选抗反馈突变菌株a. 筛选结构类似物抗性突变株用代谢产物的结构类似物处理微生物细胞，可抑制或阻遏自身的合成酶类。因此细胞由于缺少这种氨基酸不能生长或者死亡。而那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍可生长，从而可以筛选出该代谢物的抗反馈突变株。b. 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株出发菌株经诱变处理，获得对产物敏感的营养缺陷型。再将营养缺陷型进行

28、第二次诱变处理得到恢复突变株。筛选的目的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变所得的回复突变株不受产物的反馈抑制。如：谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。第三节 生产菌种的改良上述诱变育种可以获得高产菌株，缺点是工作量大，且带有相当的盲目性，不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术的发展，原生质体融合，DNA重组可以达到改良菌种的目的。一、原生质体融合（protoplast fusion）原生质体：脱去细胞壁，只有细胞膜包裹的球状体。 1.标记菌株的筛选：要求两个亲株性能稳定，并带有遗传标记（营养缺陷型和抗药

29、性） 2.原生质体的制备：用适当的溶壁酶除去细胞壁，得到两种不同的原生质体 3.原生质体的融合与再生：两个亲株的原生质体在高渗条件混合，在助融剂（融合剂）作用下融合，这是原生质体融合的先决条件。然后是细胞壁再生，即恢复完整细胞并能生长分裂(必要条件)。 聚乙二醇（PEG）脱水剂 助融剂 Ca2+提高融合频率4.融合子的选择：融合后产生两种情况: 真正的融合产生杂合二倍体或单倍重组体暂时的融合形成异核体所以要获得真正融合子，必须在融合子再生后，进行几代自然分离选择，才能确定。该方法仍属于一种半理化性筛选，因为尽管采用的两亲株的特性是已知的，但它们基因组的交换和重组是非定向的。二、DNA重组技术（

30、DNA recombination technology）又称基因工程，遗传工程。是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门技术。是按人的意志，将某一生物（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组)，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体( 受体)细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。1目标DNA片断的获得2与载体DNA分子的连接3重组DNA分子引入宿主细胞4从中选出所需重组DNA分子的宿主细胞作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。第四节 菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退衰退的原因：1.菌种保藏不当2.菌种生长条件没有得到满足二、 菌种的复壮1. 纯种分离2. 通过寄主体进行复壮3. 淘汰已衰退的个体三、菌种保藏1.原理 人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。 低温、干燥、缺氧、缺营养物质2. 方法 （1）斜面保藏