临床基因扩增PCR诊断实验室工作规范试行.docx

1、临床基因扩增PCR诊断实验室工作规范试行附件 2临床基因扩增（PCR诊断实验室工作规范（试行）为使基因扩增诊断技术规范有效的用于临床，保证检测质量，更好地为临 床疾病的诊疗服务，特制定本规范。1临床基因扩增实验室的设置：和仪器设备临床PCR实验室应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器 设备。即 1）试剂贮存和准备区； 2）标本制备区； 3）扩增反应混合物配制和扩 增区和的扩增产物分析区。如使用扩增和产物检测同时完成的荧光定量 PCR方法或全自动分析仪如Cobas- T（Anplicor）等，则3）和4）两个区可合并。与上述特定实验区有关的各个房间必须有明确的标记，以避免不同工作区

2、内的设备物品如加样器、试剂等的移出或不同的工作区间发生混淆。进入各个 工作区必须遵循一严格的）顺序，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和准备 区标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。不同的工 作区必须使用不同的工作服，可以不同的颜色来区别。此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。1.1.试剂贮存和准备区本区用于贮存溶液的制条、溶液的分装和主反应混合液的制各。本区仪器 设备配置：（ l）4 冰箱和一 20 冰柜；（2） 混匀器；（3） 微量加样器若干支（覆盖 11000pl）；（5）专用工作服和工作鞋；6)专用办公用品；7)消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压

3、处理的离。心管和加样器吸头(带滤 心)；(8)可移动紫外灯(近工作台面)。12标本制备区标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。 RNA测定时的单键。cDNA合成也在本区进行。本区仪器设备自己置：(I)4冰箱、20或-70冰柜三( 2)高达台式冷冻离心机；( 3)混匀器；( 4)水浴箱或加热模块；(5)微量如排器若干支(覆盖I1000)1 ;( 6)专用工作服和工作鞋；( 7)专用办公用品；( 8)消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的部心管和加样器吸头(带滤 心)；( 9)可移动紫外灯(近工作台面)；( 10)超净工作台；(II)超声波水浴(处理大分子 DNA适用)。1 3扩增反应混

4、合物配制和扩增区模板材料(来自标本制备区)和主反应混合液(来自试剂贮存和准备区)的加入以及扩增反应等专门在本二作区内近行。本区仪器设备自己置：(1)核酸扩增仅三(2)微量加样器(覆盖11000)1 ;( 3)专用工作服和工作鞋；( 4)专用办公用品；( 5)消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、高压处理的部心管和加样器吸头(带滤心)；( 6)可移动紫外灯(近工作台面)。1 4.扩增产物分析区本区面积应为68m。扩增严物的分析在本区进行。本区仪器设备配置：视检测方法不同而定，如为 PCR�ELISA则需(I)微量加样器若干支(覆盖 l 2s( 2)酶标权、洗报机和恒温箱 ;( 3)专用工作服和

5、工作鞋；( 4)专用办么，用品；( 5)消耗品：次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头(带滤心)；( 6)可移动紫外灯(近工作台面)。2临床基因扩增诊断实验室质量保证临床基因扩增诊断实验室质量保证涉及到整个基因扩增检测的所有阶段， 即测定分析前的标本来集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定 后的结果报告等。21标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括 EDTA或拘檬酸钠抗凝全血或骨髓、血 清或血浆痰、脑普液、尿及分泌物等。采样容器最好是密闭的一次性的，如 真空系血管。一次性塑料容器使用时无需进一步预处理。当使用非密闹采样系 统时，如尿、分泌物和骨髓的采禅，必须注意防止来自来样者的皮屑或

6、分泌物 的污染。采样者采样时起码要谈一次性手套。可重复使用的玻璃器应高压 处理，因为玻璃器（常含有不易失活的 ANA酶。RNA酶的主要来源是实验人员 的手。最好是热灭菌，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨 髓标本必须进行抗凝处理。通常 EDTA和拘檬酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝 素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去 除肝素。临床用于RNA （如HCV RNA测定的血标本最好进行抗凝处理，并尽 快（3小时以内）分离血浆，以避免 RNA的降解。如未作抗凝处理，则物血 后，必须在 1 小时内分离血清。22标本的稳定化处DNA分析，标本采集后一般不

7、需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送到 实验室。由于RNA易于降解，因此用于RNA测定的标本的稳定化处理有时是必 不可少的，Chaotropic物质特别是异硫氨酸抓盐（Guanidine thiocyanate, GITC 可使DNAse和 RNAse立即失活。在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆加入含有 GITC的试剂管中进行稳定化处理。GITC可使RNAse不可逆失活的适合浓度为5mol/L。如果GITC浓度小于 4mol/L; RNA会很快降解。在适当的稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可 邮寄。如果温度低于室温，GITC即会结晶，所以在加入标本前应使之完全溶 解。如标本不能及时送到实

8、验室，最好选用 GITC处理方法以稳定标本。23 标本的运送标本来集后应尽快送至实验室，经过适当稳定化处理的标本可在常温下通 过邮寄运送。如用于DNA提取的含EDTA的全血标本及用于RNA提取的经GITC稳定化处 理的标本。是否冷藏取决于标本的用途，较长时间在室温贮存会导致灵敏度大 大降低。通常应采用不易破碎的容器装载标本。用于 RNA检测的标本，如果在未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。24标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的核 酸样本应在 10mmol /LTris, Immol / LEDTA缓冲液（pH758. 0）中4保存。用于RNA

9、测定的核酸样本应在缓冲液中一 80C或液氮中 贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在一 20OC即可。用GIT （:稳定化处理的RNA标本在室温可保存7天，如贮存时间较长，则 RNA测定 敏感性略有下降。2.5.标本的处理（核酸提取）核酸提取是决定扩增检测成败的关键性步骤。通常,核酸制备质量不高是 由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体 或降解产物）或核酸提取过程中确.留的有机溶剂（如酚、氯份等）,这些物 质对其后的酶反应步骤具有强烈的抑制作用,从而影响靶核酸的扩增测定。如 在HBVDNAPCF测定中。采用对血清杯水煮沸裂解以释放 DNA的方法时，肉眼 观察不明显的溶血

10、也会对扩增测定有很强的抑制作用,应使用正规的核酸提取 方法（如经典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。当标本为疾时,则必须先 进行液化处理。再提取核酸。需注意的是；液化时不能加热,液化时间不能过 长。此外，当靶核酸为 RNA时，降解是一个主要问题。RT- PCR测定失败的常 见原因是标本在运送前来经充分的稳定化处理.及核酸提取试剂的 RNase的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果没.现 RNA降解的证据。实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于 后者，建议常规使用高质量的商品核酸提取试剂。2 6 靶核酸的逆转录和扩增2. 6靶RNA的逆转录cDNA合成为

11、RT-PCF中的第一个酶反应步骤，所产生的 cDNA为靶RNA的 反向互补链。为后面扩增的模板。下述因素通常影响 cDNA合成的效率：1） RT活性的降低或完全缺乏。必须排除由于酶质量不高、试剂降解或加样 错误而引起的cDNA合成不充分。2） RT或热稳定聚合酶的抑制物（如酚、血红素）。当 RNA明显为完整而 没有扩增时，应怀疑有此类抑制物。3） RNA的降解。2. 6. 2 影响扩增的因素有多种因素可引起PCR的假阳性或假阴性结果，如抑制剂或酶活性丧失（见上）、迟大温度不对、晚十十浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。反应 孔中热传导的均一性极为重要，循环仪的温度控制和加热块中热传导的一致性 必

12、须有常规的检查以避免假阴性结果。2. 7 污染在实际工作中，常见有以下几种污染类型：PCR片段的污染（产物污染）三天然基因组 DNA的污染；试剂污染（贮存 液或工作液）：以及交及污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本）。对于 所有的扩增技术，由于围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以 防止污染重在预防。一旦发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为 止。如果没有例外，实验结果必须作废，即使平行的污染质控中仅有一管显示 出有PCR片段污染。2. 7. I.测定分析前的污染源。测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。2. 7.2.测定分析阶段的污染源。通常，测

13、定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任 何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能 的污染源。如受污染的试剂（例如今血清白蛋白，明腋成矿物油）；商品酶制 剂；消耗品（如反应管，吸头）和实验设备（如加样器、离心机）。污染的来 源之一是许多样本在同时制备时的交及污染，但最主要的污染来源为以前扩增 产生的特异产物DNA片段。在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使 用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取 PCR产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定并严格执行标准操作程序。2.7.3.污染的避免。要避免污染，首先应是预防而不是排

14、除污染，前面所述工作区的严格划分 的目的正是为了预防污染。为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设 法将其破坏掉。如在扩增反应中用 dUTP取代部分dTTP从而产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿 嘧啶糖激酶（UNG），可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对将要进 行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂 素光化；单产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不妨碍 PCR 后杂交过程，所以这些方法也能防止污染。由于上面提到的方法会给人一种假 的安全感，所以不能以其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不 能防止外来非扩

15、增的天然 DNA的污染。2. 7.4.去除污染的措施。工作完后必须定期采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最 佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：用 100mlL 次氨酸钠清洁表面；试验了后长时间的紫外照射实验操作台和 其他表面；实验设备如加样器的高压消毒。28扩增产物的分析 扩增产物的测定有各种方法。如电泳、限制性酶切、斑点印迹、杂交、测 序、分光光度法定量等。但临床 PCR测定项目基本上都使用探针杂交方法。2. 8. I.与杂交检测有关的干扰。杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的 标记不够、杂交或洗涤方法不合适。最常使用的基因探针有：DNA片段、合

16、成的尊核普酸和体外的转录本（反义 RNA探针）。探针的标 记物常用的有生物素、地高辛、荧光景和同位素等。在扩增后的杂交检测中， 应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太 高都会降低杂交的严格性。还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提 高润度和或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂 是避免假阳性和假阴性结果的先决条件，要注意的是，温度和离子强度不能同 时改变。2. 9.质量控制如上所述，应该开展各种质控来评价测定分析当中各步骤的质量，如 RNA 的完整性、对扩增是否合适和敏感。2. 9.1.室内质量控制必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控

17、制，以避免假阳性和假阴性，保 证测定结果的准确性。由于 PCR测定的高敏感性，所以试剂的生产、实验材料 的准备、PCR本身和实验中的每一步都要求有质控。扩增反应前后的酶反应各 步也应有质控，只不过在质控细节上稍有不同。2911与实验材料的准备有关的质控。对 DNA 提取试剂的效果最常用球脂糖凝胶电冰来检测。可知所提取的 DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的 DNA的平均长度一般为100kb,用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为 30�40kb。然而；明显出现降解的 DNA （在1和10kb的低分子量范围内）在 经琼脂糖凝胶电冰分离和用溴化乙锭染色后也可见有

18、强的荧光信号。用对甲基 化不敏感的限制性内切酶（如 EcoR）消化DNA,然后电泳分离，能够对酶活性 的抑制剂进行质控（在抑制剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切）。潜 在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，好的 DNA 提取物， A260/A280 比值应该在1 75-20 之间；否则，污染（残留的蛋白或酚）可能会很高。仅用光度计比色方法不能对 DNA的完整性下结论。最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电 冰，这一点跟DNA分离相同，然而，如果对结果产生怀疑，就应该在变性的条 件下作琼脂糖凝胶电泳以检测 RNA的完整性。在理想情况下，三

19、种主要的核糖 体RNA（28S 18s和5S）在凝胶上出现的带相对较窄。如发生 RNA的降解。贝S 带被拖向低分子量或出现带的缺失。测定核糖体 RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰 的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在 RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因，单独的光电比色不能对 RNA的完整性下结论。291. 2.对cDNA合成和扩增的质控。本部分包括阳性质控和阴性质控。29l2. I. cDNA的合成。对CDNA合成的效率进行监控的关键性的质控是使用一个内反应质控。 cDNA的合成可以从存在子

20、每一个 RNA提取物中的cRNA转录本开始（即普遍表达 的mRNA,如核糖体蛋白转录本这一类的所谓的管家基因），也可从在制备时 加入样本中的作为内标准的 RNA开始。cDNA合成的内质控是能够产生确定产物 的阳性质控；如果扩增不成功，质控就显示出有 RNA的降解、cDNA合成的过程中错误启动或酶活性丧失。加入确定量的扩增质控物可以检测 RT&#O;PCF的灵敏度。对于RT- PCR方 法所必须的污染质控为无逆转录靶 RNA的阴性质控。2. 9.1. 2.2. PCR反应。内反应质控是阳性质控。可使用对有机体存活所必须的靶基因作质按，这 些基因至少以丰台子状态存在，因为如果基因组缺失这些基因，将

21、使有机体致 死（所谓的致死因子），一个比较好的例子就是维生素 D血浆结合蛋白的基因；在世界范围内的许多种族已发现其广泛的多态性，并且还没有发现基因活 性的同源性丢失，因此，通过 PCR共同扩增这种基因的一个片段，在所有患者 中均可获得成功，并且也会证明扩增反应是成功的。在测定血清血浆病原体核酸如 HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知的弱阳性血清/血浆作为质控样本，与持测 临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断扩增检测的有效性。使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量，还可获得有关 PCR检测下限和特异性的信息。这些质控必须使用与诊断实验（即患者的标本）所使用的相同的主反应混合

22、液。如果怀疑方法的检测下限不足以检测出产 物时，则每一个反应管都必须加扩增质控。外加阴性质控（污染质控）在每一个 PCR实验中都必须设有，应该包括几 种阴性质控。通常，这些质控是民来指明 PCR过程中污染出现的阶段。包括在样品制备 的整个过程中所带的空白反应管、含有样品制备时所用的所有反应液但不含可 扩增的模板（所谓的模拟制备）的反应管等。模拟质援可以评估 PCR实验的综合质量。此外，为对吸样过程进行质控，可以水质控样本来代替核酸样本加入 至反应管，反应管中含所有的反应成分。实际工作中仅通过水样本来检测污染 是否存在的方法是不可取的，因为它不能发现样本处理过程中的污染源，水仅 可作为扩增试剂的质控。在扩增靶RNA的PCR实验中，应做省略逆转录的污染质控，通过这种方 法，可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。29l3对测定结果评价的质控29131板上来交和膜上斑点印迹杂交的质控。在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标 本平行进行分析，这可排除不同反应中使用了不同杂交条件而造成的对结果的 错误解释。292室间质量评价能力验证， proficiency testing ）所有开展临床基因扩增检测的实验室都应参加由卫生部临床控验中心组织 的全国临床基因扩增项目的空间质量评价，并作为开展临床基因扩增诊断的依 据之一。本工作规范自公布 xx 实施。卫生部医政司