毕赤酵母实验操作手册.docx

1、毕赤酵母实验操作手册毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养

2、，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有

3、大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题1。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不

4、稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降。同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophicyeast）为代表的第二代酵母表达系统2。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点1、2、3；具有醇

5、氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。（即同源重组）菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统

6、为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模4。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品2、3。近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS

7、4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达5包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。胞外表达需

8、要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的-交配因子（-factor），能很好的达到以上的要求。并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利1、2。pPICZA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：具有强效可调控启动子AOX1（alcoholoxidase，醇氧化酶）；具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Ze

9、ocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中，100都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程5。在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZA的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。在表达载体A0X15端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X13端终止序列；分泌效率强的信号肽-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高效分泌表达质

10、粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且，有利于产物的纯化。一毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制11各种母液的配制10*YNB?（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。500*B?（0.02%生物素Biotin）?4保存保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。100*H?（0.4%Histidine组氨酸）4保存保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50以促进溶解），过滤除菌。10*D?（

11、20%Dextrose葡萄糖）保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。?10*M?（5%Methanol?甲醇）?保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。10*GY?（10%Glycerol?甘油）保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA?（0.5%ofeachAminoAcid，各种氨基酸）?4保存保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。1M磷酸钾溶液（potassiumphosphatebuffer，pH6.

12、0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。1.2常用溶液及缓冲夜1.2.1碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：?溶液：50mmol/Lglucose，100mmol/LEDTA，25mmol/LTrisHCI(pH8.0)溶液：0.2molLNaOH，1SDS（临用时配制）溶液：29.44gKAc，11.5mlAceticacid，加ddH2O至100ml。4保存。1.2.210%甘油（Glycerol）：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。1.

13、2.3?Rnase-H2O：1ulRnase加入1ml灭菌ddH2O。4保存。1.2.4?TE缓冲液：10mmol/Tris-CI（pH80），lmmol/L?EDTA（pH8.0）1.2.5?STE缓冲液：0.1mol/L,?10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)1.2.6?SCE缓冲液：1mol/LSorbitol(山梨醇),10mmol/L柠檬酸钠，10mmol/LEDTA1.2.7?1Mpotassiumphosphatebuffer（pH6.0）：?132ml1M?K2HPO4?868ml1M?KH2PO41.2.850XTAE琼脂糖凝胶

14、电泳缓冲液，pH8.0（1L）：?242 g?Tris?57.1ml?AceticAcid?37.2 g?EDTA二毕赤酵母表达的培养基配制52.1?LB（LuriaBertani）培养基：?Trypton?l?YeastExtract?0.5?NaCl?l?PH7.0制作平板时加入2琼脂粉。121高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZA原核宿主菌TOP10F时可加入Zeocin25ug/ml。2.2?LLB（LowSaltLB）培养基：?Trypton?l?YeastExtract?0.5?NaCl?0.5?PH7.0制作平板时加入2琼脂粉。121高压灭菌20min。可于室温保

15、存数月。用于培养pPICZA原核宿主菌TOP10F时，加入Zeocin25ug/ml，可以4条件下保存12周。2.3?YPD（又称YEPD）YeastExtractPeptoneDextroseMedium，（YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）?Trypton?2%dextrose(glucose)?2%+agar?2%+Zeocin?100g/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4可保存几个月。加入Zeocin100ug/ml，成为YPDZ培养基，可以4条件下保存12周。2.4?YPDS+Zeocin培养基

16、（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）：yeastextract?1%peptone?2%dextrose(glucose)?2%sorbitol?1 M+agar?2%+Zeocin?100g/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+Zeocin培养基，都必须存放4条件下，有效期12周。2.5?MGYMinimalGlycerolMedium（最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4保存，保存期为2个月。2.6?MGYH

17、MinimalGlycerolMedium+Histidine（最小甘油培养基+0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4保存，保存期为2个月。2.7?RDRegenerationDextroseMedium（葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1.?将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2.?冷却后于45水浴；3.?将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45后，与步骤2的

18、山梨醇溶液混合。4保存。2.8?RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine（葡萄糖再生培养基+0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4保存。2.9?RD及RDH平板的制备1.?将186g的山梨醇和1520g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60水浴；2.?参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，

19、预热至45后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.?迅速制备平板。4可保存数月。2.10?RD及RDH的TOP琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将186g的山梨醇和7.510g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP琼脂置于45水浴冷却、保温，备用。2.11?MD与MDHMinimalDextroseMedium+（Histi

20、dine）?最小葡萄糖培养基+（0.004%组氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5%生物素；2%葡萄糖）1.?100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2.?如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3.?如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入1520g的琼脂。4可保存数月。2.12?SOC培养基：?Trypton?l?YeastExtract?0.5?NaCl?0.05?Glucose(1mol/L)?2%121高压灭菌20min，冷却后，4保存三主要试验环节的操作3.1酵母菌株的分离纯化?接种GS

21、115于5mlYPD液体培养基，30，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4保存。3.2pPICZA原核宿主菌TOP10F的活化培养TOP10F做为菌种保存在70 条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。接种TOP10F于5mlLLB（加入25ug/mlZeocin）中，37，200rpm，培养1618小时。3.3毕赤酵母表达的试验方法?为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：建

22、立反应体系：线性化的质粒?35ul?10xCIPbuffer?4ul?CIP?1ul?ddH2O?5ul?total?45ul在PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37，15min；50，15min；56，30min（灭活）。在56未开始前停止，加入proteinseK，用于灭活CIP，加入试剂如下：反应物?45ul10x5SDS?7ul?10xEDTA（pH8.0）?7ul?proteinseK?5ul?ddH2O?6ul?total?70ul纯化使用QIAquickspinkit，按照2.2.3.3步骤进行，20ul灭菌ddH2O洗脱纯化产物。进行1琼脂糖凝胶电泳，120V，观察纯化结

23、果，并大约估计DNA浓度。3.3.2?E.coliTOP10F感受态细胞的制备及转化取10ulTOP10F菌液，接种于200mlLB液体培养基中活化培养，37，200rpm，1618小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。37，200rpm，培养1618小时。灭菌500ml离心管，4，4000rpm，20min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml液体用于重悬菌体。从制得的感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。将混匀后得200ul菌液移入电击杯中

24、。使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压2500V，时间5ms。电击后，往电击杯中加入800ulSOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5mlEP管中。37，150rpm，轻摇4560min。取全部均匀涂布于含Zeocin25ug/ml的LLBZeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37培养1216小时。*注：设空载体做对照。3.4?毕赤酵母电转化方法3.4.1菌体的准备：1.?挑取酵母单菌落，接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中，30、250300r/min培养过夜；2.?取100500l的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，2830、250300r/min培养过

25、夜，至OD600达到1.31.5；3.?将细胞培养物于4，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4.?按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5.?按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6.?按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；7.?备注：可将其分装为80l一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。3.4.2电击转化：8.?将520g的线性化DNA溶解在510lTE溶液中，与80l的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9.?将

26、电转化杯冰浴5min；10.?根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；11.?电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；12.?将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200600l涂布一块平板；13.?将平板置于30培养，直至单个菌落出现。推荐：电压1.5kV；电容25F；电阻200。电击时间为410msec。3.5?Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法3.5.1?模板的处理：1.?平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2.?将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。

27、引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；3.?用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；4.?PCR扩增，1agarose电泳；5.?对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，812小时后提质粒，酶切鉴定确认。注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），使用PCR初筛可以使工作量大为降低。3.5.2PCR反应体系：?以TaKaRaTaq

28、DNA聚合酶反应为例：组分?50l体系?20l体系10xReactionBuffer?5.0l?2.0l25mmol/LMgCl2?3.0l?1.2l2.5mmol/LdNTPs?5.0l?3.0lPrimer1（10mol/L）?2.5l?1.0lPrimer2（10mol/L）?2.5l?1.0lddH2O?31.5l?12.6lTaqDNA聚合酶?0.5l?0.2lTOTAL?50.0l?20.0l3.5.3 PCR反应条件：初始变性?94?4min?变性?94?30s?34个循环退火?505430s?延伸?72?30s?结束延伸?7210min?保存?4?3.6毕赤酵母基因组提取方法接种重组和空质粒转化子于5mlYPDZ培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30，培养1618小时。室温下，1500 g离心5-10min收集菌体100ulTE（pH7.0）重悬，加入300ulEDTA（pH8.0），0.07MTrisHCl，3ul-巯基乙醇，1ulLyticase，37水浴30min。10000g离心510min，取沉淀，加