重庆市自然科学基金.docx

1、重庆市自然科学基金项目名称：凋亡蛋白酶在登革病毒性肝损害发生中作用的研究 研究内容和意见摘要登革出血热/休克综合症的发生机理尚不明了，新近研究表明：登革病毒NS1蛋白可能参与登革休克的发生。本研究运用分子生物学技术，制备NS1蛋白及其抗体，用流式活性细胞分类法分析NS1蛋白与血管内皮细胞的结合率及其对内皮细胞骨架蛋白的影响；整合素2抗体有否阻段效应；实施动物实验，分析感染后血清NS1蛋白浓度与疾病进展的相关性。主题词1.主题词数量不多于三个; 2.主题词之间空一格(英文用/分隔)中文登革病毒NS1蛋白内皮细胞英文Dengue virus/ NS1 protein/ Endothelium简表填

2、写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最 新发布的国家自然科学基金项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术 新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写。申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请 书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求： 项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。 基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新

3、方法为主要目的的研究。 申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。 申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。 起止年月起始时间从申请的次年1月算起，终止时间为完成年度的12月。 所用实验室系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的 开放实验室。 所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填 “中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如： 中国航天工业总公司第七O一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未 编入单位代码，其代码暂不填写。 参加单位数指研究项目组

4、主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位）， 以阿拉伯数字表示。 项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作 用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。 研究内容和意义摘要与主题词均录入软盘。二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义：对应用基础研究，着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。登革热病毒（Dengue Virus）是属于黄病毒属的正股单链RNA病毒，它以蚊虫为媒介，主要引起

5、登革热和登革出血热/休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)。后者为危及患者生命的急症，死亡率极高，主要死因为出血,休克和肝损害。在我国南方及东南亚，西太平洋，中南美洲均有流行。据报告，每年世界上热带和亚热带地区约有 1亿人的健康受到该病毒的威胁。登革感染已成为上述地区严重的公共卫生问题。肝损害是登革出血热的三大死亡原因之一，但其发生机理尚不明了,缺乏合适的动物模型是肝损害发生机理不能深入研究的重要原因。在日留学期间，申请者将对登革敏感的人类肝癌细胞株（HepG2）移入严重免疫功能不全(SCID)小鼠体内，再用

6、登革病毒感染HepG2移植SCID小鼠，从而建立了该病毒感染的小鼠模型，首次在动物身上成功地再现了某些DHF/DSS的症状，为该病发生机制的研究奠定了良好的基础(Virology,1999)。利用该模型，我们对感染后肝脏损害情况做了初步观察，发现感染后早期（3 -5天），64%小鼠肝脏的主要病理变化为肝细胞出现凋亡小体,并伴有不同程度的血清转氨酶升高和病毒血症. 以往的临床观察也发现：登革病毒感染后常有肝脏受累的表现，如黄疸，肝肿大，血清转氨酶水平升高。尸检可见肝组织内出现凋亡小体，脂肪变性，枯否氏细胞肥大等。我们的结果和临床的研究报道是一致的。这提示肝细胞凋亡可能是登革病毒感染早期肝脏损害的

7、重要病理基础。因而，弄清登革病毒感染后细胞凋亡发生的机制，对于阐明肝脏损害的致病机理十分重要，而且，对其早期治疗途径的探索也具有特殊意义。目前，在复杂的细胞凋亡信号调控系统中，凋亡蛋白酶家族和核因子NF-kB的作用颇引人注目。细胞凋亡蛋白酶是1994年发现的哺乳动物蛋白酶，家族成员有10个以上，其中，凋亡蛋白酶3，8，9与细胞凋亡的关系尤为密切，而凋亡蛋白酶8和9位于3的上游，通过激活3引起该系统的级联反应，是引发细胞凋亡的一条重要途经。 NF-kB是一种具有多向调节作用的核内蛋白质，正常情况下，以无活性形式存在于细胞浆内，当某种因素（炎症，应激，感染等）使之激活后，NF-kB的二聚体从抑制亚

8、单位中释放出来转移至核内，与DNA的特定部位结合，启动基因转录，从而参与细胞凋亡的调控，是细胞应激反应的重要调控分子。研究证明：多种病毒如艾滋病毒，流感病毒，巨细胞病毒和辛得比斯 (Sindbis) 病毒均能激活NF-kB；此外也有报道认为NF-kB参与调节应激状态肝损害后肝细胞基因的表达。提示NF-kB的活化与肝损害发生和转归关系密切。但NF-kB在登革病毒性肝损害发生中的作用尚不清楚。由于NF-kB和凋亡蛋白酶共同参与某些炎症和非炎症性疾病的发生，我们推测：登革病毒的增殖及其蛋白产物在细胞内的堆积可能激活NF-kB和凋亡蛋白酶，二者协调作用的失衡可能是感染后肝细胞凋亡发生的重要调节因子。因

9、而，本项目拟利用体外培养体系和活体动物实验，研究感染后NF-kB和凋亡蛋白酶3，9 活性的变化及其在肝细胞凋亡发生中的作用。旨在阐明登革热病毒感染后肝损害的发生机理，并寻找有效的拮抗剂，在基因转录启动或信号系统激活的早期，阻断细胞凋亡的发生，探索登革热病毒性肝损害的治疗方法。本研究一旦有所发现，对于其它病毒性肝炎发生机理的阐明和治疗必将具有普遍意义。主要参考文献：1. An,J., Kimura-kuroda,J., Hi.rabayashi,Y. K.Yasui.(1999).Development of a novel mouse model for dengue virus infect

10、ion. Virology 263,70-77.2.Yamazaki,Y. et al (2000): Cytoskeletal disruption accelerates caspase-3 activation in DNA damage-induced apoptosis. Ex. Cell Res.259:64-78.3.Nakajima K. et al(2000), Structure,expression and function of the Xenopus laevis caspase family. J.B.C, 275:10484-10491. 4. Bitzer M

11、et al(1999): Sendai virus infection induces apoptosis through activation of caspase-8(FLICE) and caspase-3(CPP32). J.virol.73;702-7085.Geisbert,TW et al (2000):Apoptosis induced in vitro and in vivo during infection by ebola and marburg viruses.Lab.Invest.80:171-1856.Takizawa T et al (1999): Recruit

12、ment of apoptotic cysteine proteases(caspases) in influenza virus-induced cell death. Microbiol.Immunol,43,245-252,1999.7. Clem RJ et al(1998): Modulation of cell death by Bcl-XL through caspase interaction. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95;554-5598. Hida A et al(2000), Nuclear factor kappa B and caspases

13、 co-oeratively regulate the activation and apoptosis of human macrophages, Immunol.99:553-560.9.安静，等： dengue viru感染 用 T cell 病 与作用。日本第48届病毒学会。2000。三重10.Havert,MB et al (2000):Activation of divergent neuronal cell death pathways indifferent target cell populations during neuroadapted sindbis virus in

14、fection of mice. J.Viorl.,74:5352-6.3三、研究方案研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究内容：(1) HepG2 细胞的培养 ：DMEM 含10%FBS，常规培养， 小鼠肝细胞的培养：首先用灌流方法分离肝细胞，然后常规培养。胎儿肝细胞长期培养方法的建立。(2) 感染实验：用登革热病毒分别感染HepG2 细胞、小鼠肝细胞和胎肝细胞，做下列分析。(3) 观察指标；1 细胞的形态学变化，特别是嗜酸小体的出现；2 病毒的增殖滴度的检测和病毒蛋白在细胞内分布情况的观察。3 从感染细胞中抽出核酸产物，分析DNA的降解。4 检测感染细胞之细胞凋亡的发生率及与病毒增殖的关

15、系。5 检测感染细胞NF-kB因子的活性变化和和凋亡蛋白酶3 .8活性的变化并分析二者与病毒增殖和细胞凋亡发生的相关性。6 抑制NF-kB与DNA的结合或四肽化合物DEVD-CHO抑制凋亡蛋白酶，观察其对细胞凋亡发生的影响。（4）动物实验的实施：利用已建立的登革感染小鼠模型，从整体水平经时观察感染后肝功能的变化，肝脏组织形态学变化特别是细胞凋亡的发生率及整体条件下寡核苷酸和四肽化合物对细胞凋亡发生的抑制作用。预测目标：（1） 阐明NF-kB和凋亡蛋白酶在登革热病毒引发的肝细胞凋亡中的作用。（2） 初步解明PDTC (Prrylidine dithiocarbamate)或四肽化合物（DEVD-

16、CHO）对肝细胞凋亡的抑制作用。 拟解决的关键问题：阐明NF-kB和凋亡蛋白酶在登革出血热之肝脏损害中的作用及其机理。寻找拮抗剂，为病毒性肝损害的早期治疗开辟新途径。2拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法，技术路线和实验方案：一、登革病毒对肝细胞的影响体外实验(1) HepG2 细胞培养 ：DMEM 含10%FBS，常规培养， 小鼠肝细胞的培养：首先用灌流方法分离肝细胞，然后置37二氧化碳培养厢中培养（DMEM 含10%FBS）。 胎儿肝细胞的培养：剪碎肝组织，用0.025% 的胶原酶（I型）孵育（37，1小时）后，过滤、离心，分离细胞。Williams E 培养基（含1

17、0% FBS,EGF及胰岛素）。(2) 感染实验：用登革热病毒2（Tr1751株）分别感染Hep G2 细胞、小鼠肝细胞和胎肝细胞。观察时相点：拟于感染后12，24，36，48，60，72，96小时, 对下列指标做动态分析。(3) 观察指标：1 利用H.E.染色和TUNEL染色法观察细胞的形态学变化特别是有无细胞凋亡发生。2 TUNEL法分析感染细胞DNA的降解情况，以了解细胞凋亡的发生率。方法的基本原理是将感染的细胞与FITC 标记的dUTP及 末端脱氧核苷酸转移酶孵育，断裂的DNA片段将被FITC 标记，用流式细胞仪检测并计算阳性细胞数，即为凋亡细胞的发生率。3 分别用空斑试验和荧光抗体法

18、分析培养上清中的病毒滴度和细胞中病毒蛋白抗原的分布，研究病毒增殖，蛋白在细胞内堆积与细胞凋亡的相关性。4 用凝胶阻滞法分析感染后核因子NF-kB 活性的变化。该方法主要分三步：32P标记DNA探针；制备核蛋白核抽提物；凝胶阻滞分析。5 细胞内凋亡蛋白酶3活性的测定：应用PhiPhiLux G1D2 Kit (MBL)进行测定，方法的原理是将rhodamine标记的DEVD（凋亡蛋白酶3 的底物）与所收集的感染细胞孵育，激活的凋亡蛋白酶3将与底物反应，故流式细胞仪记数的阳性细胞百分比将代表凋亡蛋白酶3的活性。 细胞内凋亡蛋白酶8活性的测定利用其单抗，应用Western blotting进行半定量

19、。6 应用PDTC (Prrylidine dithiocarbamate)，抑制NF-kB与DNA的结合，观察其对细胞凋亡发生的影响。以阐明NF-kB在登革病毒感染后肝细胞凋亡发生中的作用。 7 分别应用四肽化合物DEVD-CHO和IETO-FMK抑制凋亡蛋白酶3 和8，观察其对细胞凋亡发生的影响，以阐明凋亡蛋白酶在登革病毒感染后肝细胞凋亡发生中的作用。8 同时应用PDTC、 DEVD-CHO和IETO-FMK, 以观察NF-kB和凋亡蛋白酶两系统的协同作用对登革病毒感染后肝细胞凋亡发生的影响。 二、登革病毒对肝脏功能的影响动物实验：利用已建立的登革感染小鼠模型，从整体水平经时观察感染后肝功

20、能的变化，肝脏组织形态学变化特别是细胞凋亡的发生率及整体条件下PDTC和四肽化合物对细胞凋亡发生的影响。可行性分析：1.已有一定的工作积累：申请者在日留学期间，在日本东京都神经科学研究所微生物研究室保井先生的指导下一直从事登革病毒的研究工作。经过几年的努力，申请者成功地制作了小鼠的登革感染动物模型，初步观察了感染后肝脏的形态和功能的变化，获得了较好的结果。同时，申请者学习了质粒制作，DNA转染，探针制备，原位杂交等分子生物学技术，积累了丰富的研究经验。申请者熟悉该项目中所涉及的技术方法，在技术上保证了该项目的顺利进行。2.具有相应的研究条件： 国内有严重免疫功能不全（SCID）小鼠生产；我校有

21、SPF动物房和感染动物房，中心仪器室有超速冷冻离心机，流式细胞仪等；我室有细胞培养室及本实验必要的细胞株（如Cos7,HepG2,Vero,C6/36等）及其它必要的仪器设备。而且，实验所需小的实验器材和试剂均可由国内购入。因而本研究课题从条件上是可行的。3. 本项目的创新之处本项目拟将培养体系和动物实验结合起来，研究NS1蛋白与内皮细胞的结合、可能机理及其这种结合在登革休克发病中的作用。这是本项目在思维方法上的创新之处。4. 年度研究计划及预期进展第一年度：(1) 小鼠肝细胞的分离与培养及HepG2 细胞的培养。(2) 培养体系感染实验的予实验(3) 感染实验的正式实验，收集标本，完成培养体

22、系各种指标的检测。第二年度 (1) 动物实验：HepG2移植SCID小鼠的制作，预实验。（2） 动物实验：感染实验，收集标本，完成即刻检测指标的分析第三年度 （1） 动物实验：完成病毒滴度的检测和病毒抗原分布的分析，形态学变化； 必要的补充实验。(2). 资料汇总，撰写论文。5. 预期研究成果(1)本研究拟从分子水平和整体水平研究细胞凋亡信号调控系统在登革热病毒感染后肝脏损害中的致病作用，期望为阐明登革病毒性肝损害的发病机制提供理论基础，并为治疗开辟新途径（2）研究结果以论文（2-3篇）形式在国内外发表四、研究基础与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩（1）申请者自1993年赴日留学

23、以来，一直从事登革病毒感染症的研究。经过几年努力， 成功地制作了小鼠的登革感染模型，于1997年在第四届flavivirus国际学会和日本病毒学会上报告，受到同行的好评。该项工作揭载在1999年Virology上。在此基础上，为研究感染后宿主肝损害的发生机理，申请者初步观察了感染后早期小鼠肝功能变化和肝脏的病理形态学变化，取得了有较好苗头的实验结果，为本项目奠定了一定的工作基础。现申请者已经完成登革病毒在中枢神经系统内传播与增殖规律及登革病毒特异性T 细胞在登革出血热/休克综合症发病中的作用机理的研究，此两项工作已总结成文并投稿。2. 已具备的实验条件,尚缺少的实验条件和拟解决的途径(包括利用

24、国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况)我校中心仪器室拥有流式细胞仪，高速冰冻离心机，电子显微镜等设备；同时有SPF动物房和感染动物房。另外，我室有蛋白分离纯化系统（BIO-RAD）、组织培养室等必要的实验条件，本项目可以利用上述条件在预定的时间内完成。7五、经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由合计23.001.科研业务费3.000.50资料费1.00学术会议费1.50论文发表费2.实验材料费17.503.00含Taq酶，连接酶、内切酶及脂质体等，2.00电镜、共焦点激光显微镜及流式细胞仪等使用费1.50组织培养用试剂，4.00生化，免疫学指标检测试剂，各种抗体2.50其它试剂、

25、细胞株等1.50消耗品（主要用于细胞培养）2.00动物（SCID小鼠，CB17+/+ 小鼠，家兔）3.仪器设备费4.实验室改装费5.协作费1.00电镜标本制作等6.项目组织实施费2.00临时工工务费，水电气费等 注：预算支出科目按下列顺序填写：1.科研业务费 2.实验材料费 3.仪器设备费 4.实验室改装费 5.协作费 6.项目组织实施费。开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。六、申请者正在承担的其它研究项目（攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况）申请者于93年8月赴日留学，2000年9

26、月底回国。 在此期间申请者承担了所在的东京都神经科学研究所登革热病毒感染动物模型制作的课题。未承担国内的其他研究项目。七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作研究工作总结摘要（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申 请 者（签章） 年 月 日九、推荐意见（不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐）。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做推荐者）推荐者（签章） 专业技术职务 专长所在单位：推荐者（签章） 专业技术职务 专长所在单位：