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1、完整超全干细胞重点知识总结推荐文档第九章 干细胞第一节 干细胞概述一、干细胞( stem cells)与个体发育正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官,这是一个彼此协调而又制约的复杂过程,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program) ,被记录在细胞基因组的结构中。不同物种有不同的遗传程序,这可能是物种在长期进化过 程中逐渐形成的。在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细

2、胞。干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,这过程即是所谓细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。干细胞在胚胎和成体组织内部的活动,包括干细胞基本特性的分子机制和调节控制、胚胎细胞的迁移活动、时空程序与相邻胚胎细胞的相互作用,对细胞增殖和分化的关系等,虽已有所了解,但由于技术上的原因,直接证据还很少,因此,干细胞增殖和分化问题仍是今天发育生物学研究的主题内容之一.二、干

3、细胞的定义和分类因干细胞是指一类具有自我更新和产生分化后代这两种基本特性的细胞。 一个充满生命力的雌雄两性机体都是由两类不同的组织和器官构成的。一类是全部由体细胞组成的,另一类是以生殖细胞为主的,也包括一些由体细胞组成的组织和器官构成的。前者是执行机体生命活动各种生理功能的;后者一切都为了保证生殖系统的卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命的。对人类来讲,从一个受精卵的单细胞要产生200多种不同类别的细胞来构成各种组织和器官,必然要靠全能性的早期胚胎干细胞通过自我更新和产生分化后代来实现的。自我更新是指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性

4、,而产生分化后代指的是干细胞还可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,而另一个是遗传特性有所不同的,要开始走上分化道路的定向祖细胞。早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,这包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞;而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。干细胞可分为两类:一类干细胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic ste

5、m cells,简称ES细胞)和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,简称EG细胞) ;另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为组织干细胞( tissue stem cells) ,又称成体干细胞(adult stem cells) 。三、胚胎干细胞研究简史哺乳动物早期胚胎体积小,又在母体子宫内发育,因此,要在体内对各类干细胞的分化及其机制进行 实验研究几乎不可能。从20世纪50年代开始,人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖

6、,又具有胚胎细胞全能性(totipotency)或多能性的(pluripotency)并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20世纪50年代末美国发育生物学家Stevens (1967)将着床前发育阶段的小鼠胚胎(包括受精卵) 或12天胚龄的胚胎生殖嵴异位移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系,揭开了胚胎性干细胞早期研究的序幕。EC细胞既具有恶性生长又具有早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。在20 世纪70年代, EC细胞常用作研究哺

7、乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型,并取得了一些重要结果。后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。20世纪80年代初,英国Evans和Kaufman以及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系,开创了ES细胞生物学研究的新时代。但此后ES细胞在其他动物上的分离和建系却颇受挫折,直到20世纪80年代后期才有所突破,见表 19.1。 20世纪90年代初,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系,同一时期,少数其他动物也相继建立了ES或EG细胞系。1998年美国威斯康星大学Th

8、omson等人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养后,首次成功地建立了5株人类ES细胞系,同年, John Hopkins医学院Shamblott等人从5 -9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。第二节 胚胎干细胞胚胎干细胞又称ES细胞主要是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞简称EG细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞,其最基本的重要特性是具有稳定地在体外自我更新并保持不分化和发育的多能性,即可以在体外分化为属于3个胚层的各种细胞。一、ES和EG细胞培养、建系技术体外培养建系

9、ES和EG细胞的技术以小鼠的最为成熟,成功率最高,其基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题。目前常用的细胞分化抑制物主要有3种:饲养层细胞( feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium) ,如BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) ,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory

10、factor, LIF) 。此外,也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,例如,白介素6 (lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同样可达到维持小鼠ES细胞的不分化状态。 因此,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类:饲养层培养法和无饲养层培养法。(一)饲养层细胞培养法不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢

11、活性。常用的饲养层细胞有下列两种:一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days post coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素C (mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM小鼠 (S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷(ouabain, O )有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(LIF)。此外,SL - M220细胞是小鼠胚胎造血的基质细胞SI/SI4经基因改造产生专一性跨膜

12、型SCF的细胞系,以它作为饲养层更有利于促进EG细胞生长。用作 ES细胞或EG细胞培养的饲养层的MEF或STO细胞均需用10 mg/L丝裂霉素C在370C灭活,用前经PBS 彻底洗涤。(二)无饲养层培养法饲养层细胞的制备在一定程度上使ES和EG细胞培养过程显得较为繁杂。近来以添加某些特定细胞的条件培养液和LIF生长因子至含胎牛血清(FCS)的正常培养液,借此替代饲养层细胞。有3种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养:直接在ES细胞基础培养液中加入重组生长因子和LIF等。Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)。2 -3周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH - CM) 。一般以2 -3份上

13、述细胞条件培养液加1 - 2份新鲜的ES细胞培养液,再添加10% - 20%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但往往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高,因此,正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES/EG细胞建系初期仍是成功的一个关键因素。(三) ES和EC细胞的体外培养1. ES细胞不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,例如,猪ICM细胞生长与 小鼠的不一样,其生长速率很慢,且有一个休眠(quiescent)时期。因此,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。例如,一般小鼠多选用3

14、-4 d的囊胚或2 - 3 d的桑椹胚,猪取8 - 10 d 的囊胚,绵羊取8 -9 d的囊胚,人和牛取7 -8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。基本培养液为含15% - 20% FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和50IV/mL青霉素、50g/mL链霉素的 DMEM液.将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35 mm培养皿中。培养2 -3天后按下列两种方法之一分离出ICM细胞进一步培养:方法一：免疫手术法(immunosurgery)。由于4 - 4.5 dpc的小

15、鼠囊胚主要由己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) ,能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。 囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H - 2b)。再移到新鲜豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状,发生免疫溶解;而ICM细胞不具H -2b抗原,不发生免疫溶解,故细胞完整元损。ICM细胞经Hanks液洗涤后,移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培液的板内进一步培养。方法

16、二:常规培养。桑椹胚或囊胚在铺有MEF饲养层的DMEM基本培养液中,未去透明带的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM细胞团从贴壁的囊胚内长出来。吸出ICM细胞团,用0.25% (m/V)膜蛋白酶(trypsin)和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在370C消化5 min.部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的24孔培养板, ICM细胞首先出现贴壁生长,继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的ES细胞团。用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团,并继续培养,一般4 -5 d间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化ES细胞,视ES细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。ES细胞在培养过程中,有时在巢状

17、干细胞团周边出现少量分化细胞,这时除了需继续维持饲养层细 胞外,在培液中再添加适量的LIF生长因子,可克服细胞进一步分化的现象。但有的物种例如猪ICM细胞对LIF并不敏感,难以抑制其在体外分化,巢状集落形成率很低, LIF不适用。ES细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种生长因子,例如表皮生长因子(ECF) ,可促进细胞DNA合成和 mRNA转录,使细胞周期的S期提前,周期缩短;胰岛素样生长因子( ICF)对ICM细胞有促进增殖作用; 干细胞生长因子( SCF)对干细胞有调控和促分裂作用,同时可抑制细胞凋亡。此外,在培液中还需添加还原剂-巯基乙醇,可使血清中的含硫化合物还原成谷胱

18、甘肽,以消除ES细胞培养过程中产生的毒性过氧化物,同时,-巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。近来注意到血清可抑制一些种类ES细胞形成克隆。因此,根据不同物种ICM细胞在体外生长状况,需要对基本培养液中的各种添加物作适当调整。2. EG细胞哺乳动物PGC细胞最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内,随着胚胎发育和纵向转折,卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠,PGC细胞也随此经背侧系膜向生殖嵴移动。因此, PGC取材主要根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。小鼠EG细胞建系基本过程如下：收集8. 5 - 10. 5 dpc小鼠胚胎,在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织

19、，以0.02% EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织, 37 0C , 15 min。吸管轻吹打散,接种于铺有MEF或STO饲养层细胞的4孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,4 - 6 d后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新的饲养层细胞上,继续培养增殖。重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞,经过同上2 -3次过程,一般可产生巢状(nests)生长的干细胞集落。最后将它转移到铺有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。 EG细胞的饲养层常用STO细胞,培养液基本同ES细胞,但除LIF外还要添加干细胞因子(SCF

20、)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。二、ES和EG细胞系基本特性(一)体外能无限增殖建系后的ES细胞在体外培养不仅能存活,还能无限增殖,这是干细胞自我更新基本特性在体外培养 中的延续。假使在培养条件合适时,ES细胞可以在体外无限增殖。但实际上,传代次数愈多,ES细胞会像常规细胞一样,出现核型不正常的情况,并失去了ES细胞原有的一些重要特性。129品系小鼠的ICM细胞是非常容易建立的ES细胞系,而其他品系的小鼠就不那么容易了,说明遗传因素是制约ES细胞建系成功与否的一个条件。ES细胞和EG细胞来自不同的发育阶段,在遗传上是有区别的,如EG细胞的胰岛素样生长因子受体基因甲基化印记修饰等,这在人

21、和其他大动物可能一样。猪EG细胞我们已建系成功,但猪ES 细胞只能在体外短期存活,还未能建系。关键可能还是培养系统不合适。表明同一品系的ES和EG细胞的培养建系条件也并不相同。(二)体外产生分化细胞ES细胞的这个重要特性同样是干细胞产生分化后代这个基本特性在体外培养中的延续。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,因此,ES和EG细胞体外培养的首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保维持其多能性的培养体系。ICM细胞一般接种于铺有灭活的小鼠MEF细胞作为饲养层的琼脂平板上,加有含抑制分化的LIF的培养液,或再添加适当的分化诱导物质(如维甲酸等) ,或通过悬滴培养成拟胚体 (embryoid bo

22、dies, EB)等特定的条件下,都极易分化产生包括3个胚层的各种类型的分化细胞,常见的是几种类型细胞混杂在一起,单一类型的细胞要靠定向诱导分化。EG细胞的分化细胞也属于3个胚层的,但工作和分化细胞种类的报道都比较少见。从1981-2003这20余年中,这2类胚胎干细胞所分化的细胞都是体细胞,未见有分化为生殖细胞的报道。这样人们就自然形成了胚胎干细胞是多能性 (pluripotency)的概念。2003-2004年国外发表了几篇文章,证明体外培养的ES细胞能产生雌、雄两性的生殖细胞,过去要证明体外培养的ES和EG细胞是否具有发育全能性,要靠把带有各种标记的干细胞注射至囊胚,再通过种系传递实验先

23、寻找干细胞嵌合到卵巢或辜丸的动物,再通过育种寻找干细胞参与卵子或精子的动物,并作纯系繁育,对大动物来说,这种嵌合体实验要花大量人力、物力和二三年时间才能完成。现在能在体外用实验证明培养的ES细胞具有发育为精子和卵子的能力,实现了体外培养的ES细胞也能表达全能性 (totipotency)概念,这不能不说是ES细胞体外定向诱导分化的一个重大突破。目前个别实验室已先后得到相同的结论,今后若能有更多类似工作的重复和考验,必将使干细胞研究推向新阶段。(三)体内产生畸胎瘤ES和EG细胞若接种于免疫缺损小鼠(裸鼠或SCID小鼠)腋窝下,或接种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝和器官包膜下,均可形成由内胚层、中胚

24、层和外胚层多种类型细胞构成的畸胎瘤。后者通过组织学检查, 可以用作分析和鉴定ES或EG细胞的发育多潜能性,判断所产生分化细胞种类的多寡。 (四)巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记ES和EG细胞在体外彼此呈现单层或多层紧密堆积,而形成岛状或巢状集落群体的生长形态。将这种岛状或巢状群体细胞的克隆挑出,用胰蛋白酶轻度消化后接种于新的饲养层或特定的条件培养液中,继续培养3 -4天后,分散的ES细胞或EG细胞又重新长出彼此紧密接触的岛状或巢状群体细胞克隆。根据经验,用dispase酶代替胰蛋白酶消化可使EG细胞少受损伤,集落形成率较高。因此,呈巢状集落生长是ES和EG细胞最具特征性的生长方式。但是,不同动

25、物ES和EG细胞巢状集落是有所不同的。例如,猪EG细胞也有自身的形态学特性,猪EG细胞集落常是圆的,比小鼠ES和EG细胞集落较扁平和较不透明。在扫描电镜中,猪EG细胞彼此比小鼠的更具有粘附性,难以解离,再培养的种植率也比大多数小鼠ES和EG细胞的低得多。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和EG细胞都具有特征性的多能胚胎干细胞的分子标记, 主要的分子标记列于表19.2.除牛的ES细胞不表达碱性磷酸酶(AKP)活性外,其他动物和人的ES或EG细胞都表达AKP的活性。分化的ES或EG细胞都不表达AKP。因此,AKP活性可作为ES或EG细胞是否分化的重要标记之一。胚胎发育阶段特异性抗原(stag

26、e specific embryonic antigen, SSEA)是早期胚胎细胞表面的一类糖蛋白,不同种类的SSE A因糖基化不同而区分为SSE A -1、SSEA -3和SSE A -4不同的表位分子。未分化的早期胚胎细胞 SSEA呈阳性,而分化的细胞为阴性。人和灵长类ES细胞表达SSEA -3和SSEA -4,而SSE A-1仅在人EG 细胞及刚开始分化的ES细胞中表达。小鼠的ES和EG细胞只表达SSE A-1.肿瘤相关抗原(tumor related antigen, TRA)是一种对唾液酸酶敏感的细胞表面糖蛋白,生殖细胞肿瘤标记(germ cell tumor marker, GC

27、TM)是另一类抗原决定簇不同于TRA的细胞表面糖蛋白。人及猴的ES细胞 与TRA -1 -60、TRA -1 - 80和GCTM -2抗体均可起反应。人与猴是近亲,因此,人与猴的ES细胞都表达 TRA分子,而啮齿动物小鼠却缺(见表19.2) ,推测TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记。Oct -4是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都表达Oct - 4(表19.2) 。(五)染色体数目和核型正常无论是小鼠或人的ES和EG细胞,经体外传

28、代培养后,具有正常的染色体数目和二倍体核型,即使冻存复苏后应仍然保持这种特性。这里,冻存与复苏的条件是非常重要的,对不同的ES和EG细胞都应专门做实验寻找最合适的冻存和复苏的条件。新建立的ES细胞系常有不正常的核型,因此,需对新建系的ES细胞进行染色体数目和核型进行分析确认,特别是为遗传操作所用的ES细胞,染色体数目和核型必须正常。同时,与普通培养细胞一样,ES和EG细胞经体外长期培养、冻存、复苏和传代,染色体和核型也会发生变化。因此,长期培养的ES和EG细胞也应做染色体数目和核型检查。(六)遗传可操作性ES细胞遗传操作的可行性是由于ES细胞在体外可以不断地自我增殖,又是具有发育的全能或多能性

29、, 并能通过构建嵌合体而产生有功能的生殖细胞。这为通过基因工程途径改造物种提供了独特的、无与伦比的受体细胞,小鼠的ES细胞的实践也证明了这一点。一般体细胞由于增殖能力差,基因修饰或改造的效率比ES细胞的低得多。ES细胞遗传操作主要有2类方法：一是通过同源重组技术去剔除ES细胞基因组的一个目的基因,所谓基因剔除(knock out)途径,其二是转染一个外源基因定点整合到ES细胞基因组的正确位置,即所谓基因定点敲入(knock in)技术。常规基因随机整合技术缺点很多,不仅易导致内源有利基因结构失活和破坏,或者激活有害基因(如癌基因等)。而且导入的外源基因的表达水平也难以预测,导致可能产生异常表型

30、的转基因动物。总之ES细胞的遗传可操作性已成为胚胎干细胞生物学的另一重要的特性。(七)形成嵌合体实现种系传递参与嵌合体实现种系传递是ES细胞生物学的又一重要概念。这在前面已有提及,只有通过形成嵌合体实现种系传递即要分析干细胞是否能参与形成生殖腺中卵子和精子才能鉴定体外培养建系的ES和 EG细胞是否具有全能性。自从20世纪80年代初小鼠胚胎干细胞建系以来,这技术是一直被沿用的,但小鼠ES细胞的生殖细胞嵌合率要高于小鼠EG细胞很多,其他动物的这类嵌合率与小鼠ES细胞相比较的材料也没有。对大多数动物而言从胚胎的ICM细胞和胚胎生殖嵴原始生殖细胞得到的体外培养建系的ES和EG细胞都应具有上列7点基本特

31、性,这也是ES和EG细胞建系的鉴定指标。人ES和EG细胞除了第七点因伦理道德原因不能实施外基本上也具有上述基本性质。三、ES和EG细胞定向诱导分化(一)基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程。早在20世纪六七十年代前,实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠胚(gastrula)的背唇(dorsal lip)的背方区域能够诱导外胚层分化为神经管,而靠近腹侧面则诱导出尾部结构。接着又发现胚胎发育中组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程,例如神经组织听囊形成后,则诱导邻近的间质细胞形成软骨囊;水晶体则剌激覆盖的外胚层诱导出角膜。在体胚胎的细胞分化过程中, 诱导作

32、用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性,同时也决定于被诱导细胞的反应能力( competence) ,后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制。诱导物质的专一性和被诱导细胞的反应能力必须在时空上相互巧妙配合,才能保证被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。ES细胞是体外研究诱导分化的较理想的模型。其在体外被诱导分化的途径可能不一定与在体胚胎细胞的完全相同,但在实验操作时,也应同时考虑诱导物的性质和ES细胞本身所具的反应能力这两个基本问题。在胚胎细胞被诱导分化实验中,所用诱导物质种类繁多,诱导模式也不尽相同,难以归类论述。但按作用机制大致可分为两类。一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤:例如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物、氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水,都能使两栖类胚胎细胞渗透压改变致成轻度损伤,导致神经细胞分化。 另一类诱导物,如类固醇激素、维甲酸衍生物(RA等) ,多肽生长因子(bFGF、TGF、Activin)等,则是通过其与被诱导细胞表面各自的受体结合而介导的细胞诱导分化。同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造,问题较复杂,不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等,而且也可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。ES和EG细胞定向诱导分化是当前ES细胞生物学研究