银杏叶提取物EGB对CCl4肝损伤小鼠的MDA含量以及SOD活力的影响毕业论文.docx

1、银杏叶提取物EGB对CCl4肝损伤小鼠的MDA含量以及SOD活力的影响毕业论文银杏叶提取物EGB对CCl4肝损伤小鼠的MDA含量以及SOD活力的影响毕业论文1材料与方法1.1实验材料1.1.1药物1.1.1.1银杏叶提取物（黄铜类） 江苏同源堂生物工程公司 批号： 临用时用0.1%吐温80，蒸馏水配制成10mg/kg，40,mg/kg， 160 mg/kg低中高三个浓度。1.1.1.2联苯双酯（15mg/丸） 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 批号：080603临用时用蒸馏水配制成0.12%混悬液取80丸*15mg/丸=120mg （120mg100ml水=0.12%）1.1.1.3 CCl4

2、北京化工厂提供 批号：080121 临用前用大豆油制成0.1%的四氯化碳油溶液。1.1.2试剂ALT试剂盒 批号：20100316；AST试剂盒 批号：20100317；SOD试剂盒 批号：20100317；MDA试剂盒 批号：20100317，均为南京建成生物工程研究所生产。总蛋白测定试剂盒 北京北化康泰临床试剂有限公司 批号：20091028 1.1.3实验动物小白鼠 清洁级昆明种兼用，体重24+2g，北京医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2004-00011.1.4 仪器1.1.4.1 电子称：ACS-A-JJ交直流电子计价秤，中航第一集团太原航空仪表有限公司生产。1

3、.1.4.2 721分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。1.1.4.3.HH-60数显恒温搅拌水箱，苏州威尔实验用品有限公司生产。1.1.4.4 FZQ-2型漩涡混合器，竞速泰县医疗器械厂1.1.4.5 电子天平，BP310P德国赛多利斯生产。1.1.4.6 离心机（KDC-1044低速离心机），科大创新股份有限公司中佳分公司生产。1.2 实验分组与处理1.2.1分组1.2.1.1 空白对照组1.2.1.2 0.1%吐温对照组1.2.1.3 模型对照组1.2.1.4 联苯双酯阳性对照300mg/kg 1.2.1.5 银杏叶提取物低浓度10mg/kg1.2.1.6 银杏叶提取物中浓度40mg/k

4、g1.2.1.7 银杏叶提取物高浓度160mg/kg1.2.2处理3月15日，随即分为七组后，灌胃给药（0.25ml/10g体重），空白对照组、模型组给予等量蒸馏水，吐温对照组给予等量吐温，连续灌胃七天，灌胃前称一次体重，灌胃后第二天再次称重，然后第四天三次称重，称重后，除空白对照组及吐温对照组外，各组动物均腹腔注射0.1%CCl4溶液10ml/kg（取CCl430l30ml大豆油），第七天灌胃给药后停食。16小时后解剖取出肝脏、脾。1.3称肝脏、脾脱臼处死小鼠，剖取肝脏、脾称重。1.4肝组织中脂质过氧化指标及抗氧化活性的测定1.4.1 MDA 含量测定方式MDA 含量测定方式是在国内外众多测

5、试方法的基础上改进的一种微量、快速、简便、准确、对操作人员健康无损害的测试方法。通过测试可反映出血清（浆）、乳汁等细胞外液、红细胞、白细胞、培养细胞以及各种动植物的细胞水平及亚细胞水平的脂质过氧化物的量。1.4.1.1丙二醛（MDA）的测定意义：机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA），引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如：醛基（丙二醛MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基可内过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不公把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧

6、能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸（PUFA）的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接的反应了机本细胞受自由基攻击的严重程度，通过SOD与MDA的结果分析有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。1.4.1.2MDA试剂盒测试原理：过氧化脂质降狗解产物中的丙二醛（MDA

7、）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥（TBA）所以此法称TBA法。1.4.1.3测试所需仪器设备可见光分光光度计，可调到95左右的恒温水浴箱（或者铝锅内放几个去掉盖子的易拉罐，将罐壁及底部穿数十个孔，以便水的进入，用来代替水浴箱。），离心机。1.4.1.4 100T试剂盒组成与配制1.4.1.4.1试剂一：液体20ml1瓶，室温保存。（天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用）。1.4.1.4.2试剂二：液体12ml1瓶，用时每瓶加340ml双蒸水混匀，4冷藏（注意不要碰到皮肤上）。1.4.1.4.3试剂三：粉剂

8、1支，用时将粉剂加入到90-100的热双蒸水60ml中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至60ml再加冰醋酸60ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。（冰醋酸自备注）1.4.1.4.4标准品：10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml1瓶，4冷藏。测试盒冷藏至少可保存一年。注：冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级即分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为99%以上。1.4.1.5 50T试剂盒组成与配制：1.4.1.5.1试剂一：液体10ml1瓶，室温保存。（天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用）。1.4.1.5.2试剂二：液体6ml1瓶，用时每瓶

9、加340ml双蒸水混匀，4冷藏（注意不要碰到皮肤上）。1.4.1.5.3试剂三：粉剂1支，用时将粉剂加入到90-100的热双蒸水30ml中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至30ml再加冰醋酸30ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。（冰醋酸自备注）1.4.1.5.4标准品：10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml1瓶，4冷藏。测试盒冷藏至少可保存一年。注：冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级即分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为99%以上。1.4.1.6规范操作方法：1.4.1.6.1操作表：标准管标准空白管测定管测定空白管10nmol/ml标准品（ml）0.1无水乙

10、醇（ml）0.1测试样品（ml）0.10.1试剂一（ml）0.10.1 混匀（摇动几下试管架）试剂二（ml）3333试剂三（ml）11150%冰醋酸1旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95水浴（或用锅开盖煮沸）40分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10分钟，（3000转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀完全）。取上清0.1ml，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管的吸光度值。1.4.1.6.2参考取样量：血清（浆）取0.1-0.2ml。低密度脂蛋白悬液取0.1-0.2ml。食油取0.03ml,肝组织、心肌、肌肉组织、螺旋藻等，取5%或10%匀浆0

11、.1-0.2ml较好。1.4.1.6.3规范操作方法标准管吸光度：当标准品取样量为0.1ml时，则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为0.065-0.070。当标准品取样量为0.2ml时，则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为0.130-0.140。1.4.1.6.4规范操作方法及简便操作方法中，若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40分钟延长至80分钟，但您的同一课题中MDA的检测都必须延长至80分钟，以免造成批间差异。1.4.1.6.5计算公式：血清（浆）中MDA含量计算公式：血清（浆）中MDA含量 测定管吸光度-测定空白管吸光度 （nmol/ml） = -标准品浓度 样本测定前 标准

12、管吸光度-标准空白管吸光度 （10nmol/ml） 稀释倍数组织中MDA含量计算公式： 测定管吸光度-测定空白管吸光度 组织中MDA含量 = 标准品浓度 蛋白含量 （nmol/mgprot） 标准管吸光度-标准空白管吸光度 （10nmol/ml） （mgprot/ml）nmol/mgprot为纳摩尔/毫克蛋白取上清100l,测定MDA含量。1.4.2 SOD活力的测定方法1.4.2.1 100管试剂盒的组成与配制：1.4.2.1.1试剂一：贮备液：10ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）； 试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4保存6个月。1.4.2

13、.1.2试剂二：液体10ml1瓶，4保存6个月。1.4.2.1.3试剂三：液体10ml1瓶，4保存6个月。1.4.2.1.4试剂四：液体350ul2支，4保存不可冷冻；4号稀释液10ml1瓶，4保存6个月。 用时两者按1：14稀释，需多少配多少。配好的试剂四4保存，不可冷冻。 注：所用吸嘴为一次性吸嘴。1.4.2.1.5试剂五：粉剂1支，用时加70-80热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分 蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后试剂避光4冷藏6个月。1.4.2.1.6试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后试剂避光4避光冷藏3 个月。显色剂的配制：按试剂五：试

14、剂六：冰乙酸=3：3：2的体积比配显色剂，4避光冷藏3个月。1.4.2.2 50管试剂盒的组成与配制：1.4.2.2.1试剂一：贮备液：5ml1瓶（天冷时或放冰箱会有部分析出，需热水浴溶解后再用）； 试剂一应用液的配制：用时加蒸馏水稀释至50ml，4保存6个月。1.4.2.2.2试剂二：液体5ml1瓶，4-10保存6个月。1.4.2.2.3试剂三：液体5ml1瓶，4-10保存6个月。1.4.2.2.4试剂四：液体350ul1支，4保存，不可冷冻；4号稀释液5ml1瓶，4保存6个月。 用时二者按1：14稀释，需多少配多少。配好的试剂四4保存，不可冷冻。 注：所用吸嘴为一次性吸嘴。1.4.2.2.

15、5试剂五：粉剂1支，用时加70-80蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分 蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4冷藏保存6 个月。1.4.2.2.6试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后试剂避光4冷藏保存6 个月。显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3：3：2的体积比配显色剂，4避光冷藏3个月。1.4.2.3总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的测定1.4.2.3.1操作总SOD（T-SOD）活力的测定：试剂（ml）测定管对照管试剂一(ml)1.01.0样品(ml)0.05蒸馏水(ml)0.05试剂二(ml)0.10.1试剂三(ml)

16、0.10.1试剂四(ml)0.10.1 用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟显色剂(ml)22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。1.4.2.3.2计算：1.4.2.3.2.1血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算：(1)定义：每亳升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。(2)血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算公式： 总SOD活力= 对照管吸光度-测定管吸光度 反应体系的 样本测试前的 （U/ml） -50% 稀释倍数 稀释倍数 对照管吸光度 1.4.2.

17、3.2.2组织匀浆中总SOD活力计算：(1)定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。(2)计算公式：组织匀浆中SOD活力 对照管吸光度-测定管吸光度 反应液总体积 （U/ml） = -50%-组织中蛋白含量 对照管吸光度 取样量 （mgprot/ml）取100mg肝脏加1ml生理盐水，研制匀浆，离心3000转，20分钟，取上清30l，测定SOD的活力；2结果2.1体重、肝重及脾重组别大号编号体重（g)3.16体重（g)3.18体重（g)3.21肝重（g）脾重(g)空白对照112525250.964 0.064 221718220.7

18、41 0.093 332727310.991 0.121 442424260.970 0.102 551517190.646 0.055 662526261.020 0.068 712628290.874 0.099 822326291.067 0.116 933132341.256 0.195 1042529331.250 0.154 1152831331.190 0.113 吐温对照 1212626291.077 0.098 1322524250.858 0.106 1431618210.735 0.061 1542324240.865 0.080 1651618200.767 0.081

19、 1762123260.908 0.053 18723201913133351.420 0.126 2022226271.116 0.150 2133033361.383 0.092 2252931331.126 0.089 2312525261.007 0.106 2422224250.990 0.038 模型对照2532324240.898 0.112 2642728301.070 0.130 2752424240.905 0.052 2862123251.195 0.214 2913033361.439 0.142 3022829291.129 0.054 3132931341.492

20、0.172 3242426271.034 0.075 3352728291.377 0.126 3412324251.078 0.097 3522524261.095 0.167 阳性对照3631921220.911 0.055 3742223220.806 0.048 3852223220.833 0.045 3912528301.144 0.122 4022829311.798 0.092 4132830311.428 0.199 4243033341.270 0.129 4352729301.414 0.133 4412423240.831 0.145 4522525250.977 0.

21、114 银低4632426270.820 0.082 4742524271.004 0.081 4852425270.911 0.085 4962726271.142 0.099 5012729301.134 0.098 5122426281.052 0.084 5232729291.162 0.073 5342425261.176 0.142 5452527281.208 0.081 5512324230.884 0.044 5622124260.972 0.098 银中 5732526261.126 0.156 5842323240.824 0.073 5952325261.039 0.1

22、07 6013031321.251 0.101 6122930301.195 0.101 6232425261.120 0.087 6342628291.094 0.109 6453030321.087 0.111 6562528301.129 0.093 6612527271.140 0.194 6722319200.924 0.122 银高 6832827271.081 0.141 6942427270.925 0.089 7052324240.921 0.102 7113032341.393 0.149 7222526291.281 0.120 7332225281.170 0.128

23、7442224251.376 0.097 7552629291.207 0.115 7662628301.366 0.138 2.2小鼠肝组织中MDA含量的变化性别组别剂量MDA(nmolmg protein-1)雌空白2.710.15吐温0.1%Tween-802.051.15模型6.122.83,*阳性药30 mgkg-13.141.32GP10 mgkg-11.890.8340 mgkg-11.881.29160 mgkg-11.440.50雄空白1.850.49吐温0.1%Tween-801.870.48模型3.051.85阳性药30 mgkg-12.541.39GP10 mgkg-1

24、1.820.2440 mgkg-11.270.32160 mgkg-12.321.13EGB对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脂质过氧化产物的影响(n=5)Effect of GP on lipid peroxidation (MDA) of hepatic tissue in mice with CCl4-induced injuries. (n=5)注：为与空白对照组比较P0.05；为与空白对照组比较P0.01；*为与溶剂对照组比较P0.05；*为与溶剂对照组比较P0.01；为与CCl4模型组比较P0.05; 为与CCl4模型组比较P0.01;2.3肝组织中MDA含量的变化的结果分析结果显示：雌

25、性小鼠模型组与空白组相比较，模型组小鼠肝组织中MDA含量非常显著上升(P 0.01)。模型组与吐温对照组相比较，模型组小鼠肝组织中MDA含量非常显著上升(P 0.01)。 阳性组与模型组相比较，阳性组小鼠肝组织中MDA含量显著下降 (P 0.05)。低中高浓度的EGB与模型组相比较，EGB组小鼠肝组织中MDA含量非常显著下降 (P 0.01)。雄性小鼠模型组与空白组相比较，模型组小鼠肝组织中MDA含量无显著差异。模型组与吐温对照组相比较，模型组小鼠肝组织中MDA含量无显著差异。 阳性组与空白组相比较，模型组小鼠肝组织中MDA含量无显著差异。低中高浓度的EGB与模型组相比较，低高浓度的EGB组小

26、鼠肝组织中MDA含量无显著差异，中浓度EGB组小鼠肝组织中MDA含量显著下降 (P 0.0)。2.4小鼠肝组织中SOD活力的变化性别组别剂量SOD(Umg protein-1)雌空白330.5726.79溶剂0.1%Tween-80298.1947.63模型213.057.85,*阳性药30 mgkg-1292.9950.11GP10 mgkg-1318.3560.6340 mgkg-1329.1428.77160 mgkg-1377.9336.99雄空白303.9420.93溶剂0.1%Tween-80291.1122.50模型272.6334.92阳性药30 mgkg-1318.6553.09GP10 mgkg-1321.8584.0040 mgkg-1336.6811.66160 mgkg-1409.6425.21EGB对CCl4致急性肝损伤小鼠抗氧化活性的影响(n=5)Effect of GP on antioxidation activity