内生真菌对草坪草的影响与应用.docx

1、内生真菌对草坪草的影响与应用專題討論內生真菌對草坪草的影響與應用指導老師：王裕文 助理教授報告學生：胡智益報告日期：1999年四月一日報告時間：上午十點十分報告地點：農藝館108室一.前言： 內生真菌（endophyte）在草坪草上已經應用多時(C.W. Bacon et al.,1997)，但並非所有內生真菌都可應用在草坪草上。內生真菌可提供真菌毒素（mycotoxin）以抵抗病蟲害，此外還可提供一些機制，增強植物忍受逆境的能力。而內生真菌屬於異營生物，需要從植物體內吸取少量養分，以供生存所需。因此，兩者的關係可說是共生，Clay（1988）更進一步將這種關係稱為”防禦的互利共生（defen

2、sive mutualism）”。 雖然內生真菌有很多優點，但當家畜誤食到這些含有內生真菌的草類時，便會有睡眠、昏迷等中毒現象。因此如何適當利用內生真菌來改善草坪草的品質，以下文章將有詳細介紹。二.內生真菌的分類及生理特性：大部分草坪草的內生真菌是屬於子囊菌的麥角菌科(Ascomycete family Clavicipitaceae)。在熱帶草坪草種中，內生真菌是以Balansia為主，主要分布在美國，此類型的真菌無法穿透草坪草種子，因此限制了其應用性。而在溫帶的草坪草種中，以香柱菌屬（Epichloe）和Neotyphodium( = Acremomium)為主，它們分布於全世界，Whit

3、e估計全世界約有10%的溫帶草種已感染香柱菌屬（Epichloe），這些草種包括fine fescue (Festuca rubra, F. ovina等)，高狐草(F. longifolia Thuill)，Arizona fescue(F. arizonica Vasey)，一年生及多年生黑麥草(L. perenne,L. temuletum等)，早熟禾(Poa spp.)等(White,1987;Clay and Leuchtmann,1989;Clement and Kaiser,1994)。這兩類型的真菌可穿透草坪草種子，所以能應用在增進草坪草的表現上。麥角菌科的真菌不會呈現分枝狀，

4、以迴旋型為主，其菌絲是存在於草坪植物的細胞間隙中（圖1）。通常在草坪草的葉鞘、再生莖桿及種子可見菌絲的分佈。大部分的內生真菌在高狐草和多年生黑麥草中可找到其蹤跡，它們通常是依賴寄生種子而達到傳播的目的。當寄主植物由營養生長期進入生殖生長期時，內生真菌會隨著寄主頂端的分生組織漸漸移至花序，再隨著花序的發育進入種子。一旦進入種子後，內生真菌會在糊粉層中增殖，接著開始蔓延至全部的種子中，直到種子萌芽，真菌會重新感染新的幼苗。雖然內生真菌以異營為主，但它們通常只需從寄主體內吸取少量的養分，且不會在寄主表面產生任何病徵。圖1. 麥角菌科的真菌為迴旋型，其菌絲是存在於草坪植物的細胞間隙中。（M.D Ric

5、hardson et al.,1998）在香柱菌屬（Epichloe）中，有三種基本生活史的模式(White,1988)。第一種模式是內生真菌會產生stroma，影響草類花序的生長，進而造成草類的不孕。stroma是香柱菌屬（Epichloe）和所有麥角菌科之內生真菌的生殖構造。此構造是發展生殖細胞所必備，但此構造發育時，需從寄主體內吸取大量的營養成分，以供其生長。在歐洲的orchard-grass(Dactylis glomeraya L.)，若受到內生真菌 E. typhina 和 E. baconii 的感染，會造成典型的“阻塞病(Choke disease)”。在剪股穎(Agrosti

6、s hiemalis)中，已共生且生成stroma之植株比已共生但未生成stroma之植株的平均莖桿重少了44%(White and Camp,1995)。由此可知，真菌會吸收植株用來發育花序的營養物質。因此，內生真菌在stroma時期對寄主植物來說，是一種具有危害性質的病原菌。第二種模式是會產生stroma，並同時具有穿透種子的能力。在這種模式中，寄主種子的生產量減少，但並不會造成不孕。很多品種的chewing fescues(F. rubra mutata)都含有內生真菌 E. festucae，會降低以生產種子之植株的莖桿重，不過，根據種子生產者的說法，一些商業品種因活力增加，會限制st

7、roma的發育，而提高種子的產量(Sampsou,1993;Leuchtmann et al.,1994)。第三種模式，內生真菌不會產生stroma，但對種子具有穿透的功能。高狐草和多年生黑麥草通常是利用此種模式的內生真菌(N.coenophialum 及N.lolli 作代表)。這種內生真菌除非以顯微鏡觀察或利用免疫分析來偵測，否則不易被察覺。這三種內生真菌以第三種模式，最常被廣泛應用，而第二種模式也曾被利用，至於第一種模式則完全不考慮。因此本文最主要是討論有關第三種模式生活史的內生真菌。 一些含有內生真菌的草種對家畜是有毒性的，包括高狐草，多年生黑麥草， sleepy grasses (A

8、chnatherum spp.)， huecu grasses (Poa hueca Parodi)和dronk grass(Melica decumbens Thub)。在含有內生真菌的sleepy grass，包括亞洲的Achnatherum inebrians (Bruehl et al.,1994)和北美的A. robustum Vasey 會產生麥角酸（lysergic acid amide）(Powell and Petroski ,1992)，而引起睡眠的效應。當動物（特別是馬）吃了足夠份量的sleepy grass，牠們可能會熟睡23天。在南美洲的巴塔哥尼亞(Patagonia

9、)草原及安地斯山(Audes)，含有F. argentina 和P. huecu的內生真菌會產生糖蛋白(glycoprotein)，會導致動物吃食後步履蹣跚(Bertoni et al.,1994;Pomilio et al.,1989)。內生真菌具有毒性的原因是因為它們會產生一些化學物質，稱為真菌毒素（mycotoxin）(表1)，對生物的生理活性有很大的影響。這些真菌毒素大部分屬於生物鹼，包括ergopeptine alkaloids、indole-isoprenoid lolitrems、pyrrolizidine alkaloids和pyrrolopyrazine alkaloids等

10、（Porter et al.,1981;Yates et al.,1990;Rowan and Gaynor,1986;Siegel et al.,1990）。內生真菌的毒性會隨著時間及空間而改變。內生真菌的菌絲量及真菌毒素的製造量會因季節不同而產生差異（Breen,1993; Agee and Hill,1994）。雖然菌絲的位置和真菌毒素並非絕對正相關（Keogh and Tapper,1993），但在出現菌絲組織如crown、葉鞘、髓，花序和種子，毒素的濃度通常很高（Azevedo et al.,1993;Bush et al.,1993）。Neotyphodium SpeciesBal

11、ansia SpeciesErgovalineErgonovineErgosineChanoclavine IPeramineIndole acetic acidErgosterolErgosinineCyclopentanoid sesquiterpenoidsCaffeic acid-Coumaric acid-Hydroxybenzoic acidLolineN-AcetyllolineN-Formyl lolineN-AcetyInorlolinePaxillineLolitrem ALolitrem BLolitrem CLolitrem DElymoclavineErgonovin

12、eErgosineChanoclavine IIsochanoclavine IAgroclavineDihydroelymoclavine6,7-SecoagroclavinePenniclavine3-Indole-acetic acid3-Indole ethanol3-Indole acetamideMethyl 3-indole-carboxylateErgobalansineErgobalansinine表二.內生真菌之二次代謝物（真菌毒素）。（M.D Richardson et al.,1998）三.內生真菌對草坪草的貢獻：1.抗蟲性：在草坪草或牧草中，內生真菌對寄主抗蟲性有正面

13、性的效果(Dahlman et al.,1991；Latch,1993；Breen,1994；Clement et al.,1994)。在紐西蘭，感染內生真菌的多年生黑麥草對阿根廷莖象鼻蟲(Argentine stem weevil)有優越的抗性(Prestidge et al.,1982)。在草坪草抗蟲性最強的部位是在近crown的部分及植株地上部，包括葉鞘。而它對於寄生根部的昆蟲，如雞母蟲（Scarabaeidae spp.），也有不同程度的抗性(Potter et al.,1992)。 抗蟲的機制主要是由於共生於草坪草的內生真菌所放出的真菌毒素。這些不同的毒素可嚇阻或改變特殊害蟲的進食行

14、為（Siegel et al.,1991）。一些生物鹼會以協同作用（synergism）的方式拮抗某些蟲害（Yates et al.,1989;Siegel et al.,1991）。雖然內生真菌可抑制很多蟲害，但一些昆蟲仍然持續生存。這原因有兩點，一.部分昆蟲體內有抗真菌毒素的物質。二.和昆蟲的進食行為有關，也就是說抗蟲的效果會隨不同的進食方式而改變。前文提到，內生真菌的毒性會隨著時間及空間而改變，因此抗蟲的效果也會變化。在適當的季節時，內生真菌有很高的活性，會對某些會吃食植物特別組織或器官的昆蟲，有抑制的效果。此外，在寄主植物的基因因子對真菌毒素的表現程度和對特定生長時期的昆蟲，也對抗蟲性

15、具有相當程度的影響（Agee and Hill,1994;Clement et al.,1994）。 內生真菌在組織中的分布不同，就可能對昆蟲有不同程度的抗性。若真菌毒素只在內生真菌體內出現，而不釋放到寄主體內，那麼昆蟲需要直接取食植物體內含有菌絲的部分，才可達到抗蟲的效果。對於一些咀嚼式口器的昆蟲，如夜盜蛾的幼蟲，抗蟲性就很高（Johnson-Cicalese and White,1990;Breen,1993）。然而對一些刺吸式口器的昆蟲，如蚜蟲（Schizaphis spp.），則需要在植物體液內出現真菌毒素時，才可達到抗蟲效果。為了抗此類昆蟲，內生真菌需分泌真菌毒素到植物體內的非原質體

16、（apoplast）中，這些毒素再隨著維管束組織（如韌皮組織）運輸。當蚜蟲以口器刺入植物體內的韌皮組織時，便吸食到毒素而導致死亡。2.真菌性病害的抗性： 早期的文章曾指出在體外（in vitro）的內生真菌可拮抗真菌性病原菌（White and Cole,1985;Siegel et al.,1991），此觀點被認為在一些共生性內生真菌也具有抗病性。不過在一些植物抗病害的研究發現，這觀點並非完全正確。高狐草對莖銹病(stem rust，Puccinia graninis subsp. graminicola)或葉斑病(leaf spot，Rhizoctonia zeae Voorhees)的病

17、害反應，並不受內生真菌之共生所影響（Chu-Chou et al.,1992）。而在共生的高狐草幼苗，可增加褐斑病(brown patch，R. solani Kuhn)的抗性，但對夏斑病(summer patch，Magnaporthe poae)並無影響（Gwinn and Bernard,1988）。最近的證據指出，在一些品種含有內生真菌的fine fescue對dollar spot(Sclerotinia homeocarpa)有很好的抗性（B. B. Clarke,Rutgers Univ.,1996,unpublished data）。 事實上，由於在草坪草生態中，病害的表現是涉

18、及到病原菌菌株、寄主基因型、環境因子及其他生物的交互作用，因此真菌性病害的抗性是一種相當複雜的反應。舉例來說，若以共生的方式，使fine fescue能抗Sclerotinia spp.，則抗病的效果可能不是內生真菌直接抗病原菌所造成，而是間接透過強化寄主的能力，包括降低植冠的溫度、增加草坪草的密度、增強水份吸收的能力、加強植物耐逆境的能力等方式，以增強植物對病害的抗性 (Bacon et al.,1997)。3.對其他生物的抗性： 雖然真菌性疾病及昆蟲是草坪草主要的病蟲害，但其他病原生物也不可被忽視（表2）。由細菌（如Xanthomonas campestris和Pseudomonas co

19、ronafaciens）或病毒所引起的病害，也會降低草坪草的品質，但這兩類病害往往不易以植株外觀來診斷（Smiley et al.,1992）。細菌性病害是溫帶型草種常見的病害。目前還無法證實內生真菌是否和抗細菌性病害有關連。雖然病毒性病害在草坪草上問題不大，但有很多草種交替成為病毒的中間寄主，進而感染其他植物。如在高狐草中的大麥矮性黃化病毒（barly yellow dwarf virus, BYDV）（West et al.,1990），這種病毒主要是由一種蚜蟲（oat birdcherry aphid, Rhopalosiphum padi）所傳播。和內生真菌共生的植株可降低BYDV的發

20、生率，可能是因為媒介昆蟲的數量減少了（Wset et al.,1990）。因此若能在果園或園圃中利用含有內生真菌共生的草坪草，就能減少和草坪草近緣的寄主植物感染病毒性疾病的機率。 線蟲也會危害草坪草，因所造成的徵狀和營養缺乏或其他逆境相似，所以線蟲也不易被診斷出來。對受不同種類的內生真菌感染的草類來說，抗線蟲的效果是不一致的（Cook et al.,1991），例如以Tylenchorhenchus sp.，Paratrichodorus sp.，Helicotylenchus sp.，和Meloidogyne sp.和高狐草共生，則可藉著降低線蟲發生的機率、減少根被吃食、及減少卵的產生，來達

21、到抗線蟲的效果（Gwinn et al.,1993;Pedersen et al.,1988;West et al.,1988;Kimmous et al.,1990）。利用內生真菌抗線蟲，可產生健康的根系，間接增強耐旱性。另外有一些小動物，包括鳥類和哺乳類動物會以草的葉片或種子當作食物，因此和內生真菌共生的草類，可防止這些小動物的吃食。例如：啃食共生性高狐草的老鼠，會降低生殖能力，進而減少族群數（Zavos et al.,1986,1988;Sadler,1980）。另一個例子是當吃種子的鳥類吃食共生草種的種子時，會降低食慾，或體重減輕（Madej and Clay.,1991;Conove

22、r and Messmer,1996;Zavos et al.,1993）。可是這點對於生態保育是非常不利的。而在一些特殊情形下，種植共生草種是有用的，如種植在高度危險地帶如路邊或飛機跑道旁的草坪草，可防止小動物吃食，並間接保護牠們。4.忍受非生物性壓力的能力： 經過上述的討論，因為內生真菌會增進寄主對病蟲害的抗性，而帶給自然生態系或人為生態系很大的改變。然而，內生真菌也可提供對非生物性壓力的忍受性，如增強耐旱性及其他逆境的忍受性。草坪草的耐旱性在水源不足的地區是很重要的，有些草種如高狐草已能適應乾旱的環境，但內生真菌能提供更高的耐旱性。Arechavaleta等人（1989）在溫室觀察的結果

23、，證明內生真菌可以增強高狐草的耐旱性。根據推測，內生真菌能增進高狐草的耐旱性是由於（1）促進根的發育（Belesky et al.,1989），（2）增加葉的生長：葉片增厚、葉片捲曲、再生能力增強（Arechavaleta et al.,1989），（3）調節氣孔的開合（Elmi et al.,1995），（4）滲透調節：a.共生植株在葉鞘細胞中，葡萄糖及果糖濃度增加，未共生植株在葉鞘細胞中的醣類濃度不變（Elmi et al.,1995）;b.共生植株葉片中的細胞壁彈性較大（White et al.,1992）。然而，由於大部分的資料變異性太大，無法準確推測，以致內生真菌和寄主間的生理反應仍

24、不清楚，。寄主的基因型、內生真菌的菌株和環境因子造成這個複雜性（Hill et al.,1991;Agee and Hill,1994）。 因為具有內生真菌的植株在乾旱環境下會刺激滲透調節的發生，因此學者認為內生真菌能增強植株對高溫、低溫、及鹽害時出現缺水現象的忍受力。不過這觀點是否正確，仍須進一步研究來證明。四.一些限制草坪草內生真菌利用的問題：欲將內生真菌成功的應用在草坪草上，仍有很多問題需要解決。以下便詳細探討會限制應用的因素：（M.D Richardson et al.,1998）1.潛在性毒素： 當我們將內生真菌併入草坪草品種的同時，也該重視家畜中毒的潛在危險。在草坪草種子的生產田當

25、種子收穫後，農田中所剩餘的莖桿和殘株，可以當作低品質的飼料來餵飼家畜。因為在高狐草和多年生黑麥草中廣泛的利用內生真菌，若以種子收穫後的草坪草莖桿當飼料，會發生動物中毒的問題，測量莖桿內之ergovaline的含量竟高達209ppm（Craig et al.,1994）。因此當利用特殊菌株（特別是加強毒性的內生真菌）發展新品種時，必定會引起很大的爭議。所以適當利用生產種子的莖桿當飼料，這點是很重要的。另一項爭議是有關於高狐草，因高狐草是一種多用途的草類。限制高狐草莖桿的供應，可能會促使含有高量內生真菌的種子進入牧草市場，再次造成家畜中毒的問題。最有效解決這些爭議的方式是發展疫苗或治療劑以改善共生

26、草種的毒性。若替家畜注射單源抗體（monoclonal antibody），這些抗體會和內生真菌產生的生物鹼結合，以增加血清內蛋白質的含量（Thompson et al.,1993），使代謝改變，消除毒性。另外還有一種含有ivermectin的藥品，也可改善毒素病，它是家畜管理者所使用的一種抗寄生藥品。在阿拉巴馬州（Alabama）的一項實驗，餵食共生草類並以ivermectin治療的牛隻，其情形等於餵食未共生草類的牛隻（Bransby et al.,1992），當其他疫苗或治療劑正發展時，這項起步的成功說明可透過製藥的方式克服潛在毒素的問題，因此研究如何增進草坪草內的內生真菌含量，將不再具有

27、風險。 2.缺乏自然界中寄主和內生真菌相互作用的訊息： 雖然我們知道內生真菌對草坪草的貢獻很大，但目前仍對內生真菌和寄主間的關係所知有限，尤其是真菌在寄主體內的增殖及營養交換的情形。前文提到受內生真菌感染的植株後，會增加活力，並提高對非生物性壓力的忍受性，但對於這些生理機制的所知極少。因此，建立內生真菌和寄主間之交互作用的知識是必須的，如此才可更快、更有效率利用內生真菌來改良草坪草。3.需要發展感染的方法： 內生真菌可利用選拔和回交的方式直接接種到未受感染的幼苗或分蘗（Bacon and White,1994）。在過去三十年間，溫帶草的育種學家開始選拔含有高比例內生真菌共生的草坪草，經過進一步

28、的篩選及選拔，可讓超過95的品種含有內生真菌。有些缺少內生真菌但仍具有期望性狀的育種材料，是不會被丟棄的。因此，必須經由其他方式內生真菌導入這些剩下的優良育種材料中。一些培養的技術可將內生真菌導入幼苗（Latch and Christensen,1985），分蘗中的分生組織（Osullivan and Latch,1993），體細胞胚（Kearney et al.,1991），和成熟的分蘗中（Belanger），但成功率通常很低，大約是050。幼苗感染是最常用的方式（Latch and Christensen,1985），但成功感染後，會構成不同結合的形式。理論上，利用感染不同來源的內生真菌體

29、細胞胚的方式可產生營養繁殖的植物，但這項方法受限於天然體細胞變異極少，因此只能利用組織培養的方法達成（Roylance et al.,1994）。 萌芽的技術，包括分蘗分生組織及成熟分蘗的接種。提供更多寄主和內生真菌的結合方式，使期望性狀更能表現。不幸的，這些技術仍停留在初期，他們還沒完全應用在實物上。4.在種子時期存活率很低： 之前提過大部分期望的內生真菌都具有種子穿透的能力。感染內生真菌的種子是最方便的種植材料。然而，在一般儲存的方式下，如低溫冷凍會使內生真菌無法存活。因此儲存種子會加速內生真菌的消失，這還包括儲存在高溫及高濕度下的種子（Welty et al.,1987）。在不合適的儲存

30、條件下，在一年內會失去所有的內生真菌。以fine fescne為例，在收穫後幾個月內，內生真菌便會失去活力。不當的儲存方法限制了內生真菌在fine fescne上的應用價值，因此，必須找出另一種可適應一般儲存方式的內生真菌菌株。5.Stroma的形成會使種子減產： 在草類莖桿中形成stroma會導致種子生產下降，並可能對共生草坪草的使用者造成一種困擾。在高狐草和多年生黑麥草中，內生真菌不形成stroma，但在剪股穎和fine fescue，內生真菌會形成stroma，使種子減產。因此，我們需要找出不會製造stroma且可親合於草坪草的內生真菌，將之併入草坪草品種中。6.在一些草種中缺少內生真菌

31、： 雖然內生真菌已在很多草種應用，然而並非所有的草坪草種都能和內生真菌共生，例如兩個應用很廣的草種Kentucky bluegrass 及 creeping bentgrass，因寄主和真菌的不親和性，而限制了內生真菌的應用（Koga et al.,1993）。，很多未被栽培而具有內生真菌的近緣草坪草種，可用來當作接種內生真菌於Kentucky bluegrass及creeping bentgrass的育種材料，而達到合併內生真菌的目的。另外，還可利用共生的近緣野生草種和這些栽培種雜交以轉移和內生真菌親合的性狀。五.結語： 內生真菌對草坪草的應用是極具潛力的。但目前仍有很多問題需要克服，若能克服這些障礙，相信未來內生真菌在草坪草的應用上一定可以有更寬廣的發展空間，來改善草坪草的品質。