银胶浓度83修改.docx

1、银胶浓度83修改银胶浓度对电穿孔法获取细胞内表面增强拉曼光谱的影响俞允，林居强1，陈荣11.医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建省光子技术重点实验室，福建师范大学， 福州 350007摘要：采用鼻咽癌细胞C666为研究对象，测量六组不同浓度银胶电穿孔后活细胞内表面增强拉曼光谱(SERS)。以光谱强度积分值和光谱重复性为指标，研究银胶浓度对电穿孔法获取细胞内SERS的影响。结果表明：在穿孔脉冲电场强度875 V/cm，脉冲持续时间1 ms，电穿孔两次的条件下，每500 l电击缓冲液中含有50 l银胶测得的细胞内SERS信号信噪比高且光谱具有较好重复性。银胶浓度增大在增强光谱信号的同时会导致光

2、谱重复性下降。对电穿孔后活性C666细胞内SERS平均光谱进行初步谱峰归属。通过优化银胶浓度，可以提高电穿孔-SERS效果，获取更好的细胞内SERS信号。关键词：表面增强拉曼光谱(SERS)；电穿孔；银胶浓度；C666细胞中图分类号：R282.5,R284.1 文献标识码：A 文章编号：引 言表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman scattering，SERS）具有良好的特异性、选择性以及敏感性，在生物化学分析中起显著作用1,2。在对细胞内SERS光谱研究中，往活细胞内引入金或银纳米粒子作为增强基底来获取细胞内表面增强拉曼光谱。当前常用方法是将细胞与金或银纳米粒子充分

3、混合孵育培养，利用细胞内吞作用使金、银纳米子进入细胞来增强拉曼信号，从而测得细胞内SERS信号3。此外，生物自体合成金属纳米粒子也被应用在细胞内SERS测量上4。可是细胞内吞作用或自体合成金属纳米粒子都需要较长时间，拉曼光谱测量前细胞一般要孵育培养20 h以上，而细胞在这一时间内发生的生化变化，可能影响检测结果。因此，研究寻找一种方法使金属纳米粒子快速进入细胞，以实现细胞内SERS光谱及时检测，对细胞等生命组织的研究具有重要意义。基于以上SERS研究的现状，我们首次提出并实现电穿孔-SERS方法，即利用电穿孔技术，在30 min内快速将金、银纳米粒子导入活性细胞，并成功测得活细胞内SERS信号

4、5。电穿孔技术是将细胞置于可控电场中，在瞬时高强度电场作用下，细胞膜上出现可逆性的微小孔洞，暂时提高细胞膜通透性，使周围介质中的外源分子更容易进入细胞内【6】。尽管电穿孔技术对于很多大分子而言是很有效的导入技术6,7，但是电穿孔导入银纳米粒子过程中使用的银胶浓度对于细胞穿孔后SERS测量结果有很大影响。银胶浓度直接关系到电穿孔导入活细胞内的银纳米粒子数量和聚集程度，浓度过低将导致电穿孔后测不到SERS信号或信噪比差，而过量的银胶容易聚集附着于细胞外，难以清洗干净，对实验准确性造成影响。此外，纳米银生物兼容性不好8，大量银胶对细胞生物活性具有杀伤作用。因此，寻求最佳银胶浓度对于提高电穿孔-SER

5、S方法的效果，实现良好的细胞内SERS光谱检测具有重要意义。本文将以人鼻咽癌细胞C666为研究对象，测量六组不同银胶浓度下C666细胞电穿孔后的SERS光谱，研究银胶浓度对于电穿孔法获取细胞内SERS光谱的影响，以获取最佳银胶浓度。1 实验器材与方法1.1 实验试剂硝酸银（AgNO3）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸羟胺（HONH3Cl）均为分析纯化学用品，购自广东化工厂；RPMI 1640培养液购自GIBCO；PBS粉购自BOSTER。实验均使用超纯水。1.2 实验仪器ECM 830电穿孔仪（BTX公司）；电击杯（间距4 mm，容量0.8 ml，BTX公司）；Renishaw inVia型共聚焦

6、显微拉曼光谱仪。1.3 银胶制备银胶制备采用盐酸羟胺还原硝酸银方法9。将4.5 ml氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）加入到5 ml盐酸羟胺溶液（0.06 mol/L）中，然后将混合物快速添加到90 ml硝酸银溶液（1.110-3 mol/L）中，加入过程中快速搅拌直至得到均匀乳灰色银胶溶液。室温下避光封存。使用前10000 r/min离心10 min后弃去上层液获得浓缩银胶。1.4 C666细胞培养人鼻咽癌C666细胞株由福建协和医院提供，本实验室培养。C666细胞单层贴壁生长于pH值7.2，含10%小牛血清及双抗（100 IU/ml青霉素、链霉素）的RPMI 1640培养基中（以下简称RP

7、MI 1640完全培养液），于5% CO2、饱和湿度、37 培养箱中传代培养。选择对数期细胞进行电穿孔实验，电穿孔前收集C666细胞，离心并重悬于RPMI 1640完全培养液中（电击缓冲液即为RPMI 1640完全培养液），计数调节细胞密度为1106 /mL。1.5 实验方法分别将5，10，25，50，75 l离心浓缩后的银胶用RPMI 1640完全培养液稀释成100 l，再取100l离心浓缩后的银胶（不稀释），制成六组不同浓度银胶各100 l。将这六组银胶各取100 l分别与400 l细胞悬液充分混匀于电击杯中。六组银胶浓度分别为：5l /500l、10l /500l、25l /500l、5

8、0l /500l、75l /500l和100l /500l。对照组不加银胶，直接将100 l RPMI 1640完全培养液与400 l细胞悬液混合均匀于电击杯中。穿孔前将电击杯冰浴(04 )10 min。电穿孔参数为脉冲电压350 V（电场强度875 V/cm），脉冲持续时间1 ms，电穿孔两次。每次电击后都将电击杯冰浴10 min。穿孔结束后，将细胞从电击杯移至EP管中，PBS离心清洗细胞三次，洗去附着在细胞外的银纳米粒子和缓冲液，避免对SERS测量造成干扰。最后将细胞置于样品池中，对照组及六个不同银胶浓度组均随机测量三十个细胞的拉曼光谱。使用Renishaw inVia型共聚焦显微拉曼光谱

9、仪测量细胞拉曼光谱。激发光波长785 nm，激发光功率20 mW , CCD取谱时间10 s。在50物镜下测量细胞拉曼信号。加入针孔（pinhole），调节光斑大小使其覆盖整个细胞从而获取全细胞信号。测量获得的每个光谱原始数据均扣除荧光背景，从而获取细胞Raman光谱。2 结果与讨论2.1银胶电镜及紫外/可见/近红外吸收光谱银胶透射电镜图像由中国科学院福建物质结构研究所测量，银纳米粒子直径约为40 nm。使用Lambda 950紫外/可见/近红外分光光度计测定银胶吸收光谱，银胶吸收峰在419 nm处（图1）。2.2 不同银胶浓度电穿孔后细胞内SERS光谱图2A为对照组及六个不同银胶浓度组电穿孔

10、后的细胞内SERS光谱。图中编号5，10，25，50，75，100 l分别代表六个银胶浓度组中测得的细胞内拉曼谱线，谱线Ctrl为对照组（电穿孔时不加银胶）。如图2A所示，对照组没有明显的拉曼谱峰，说明在激发光功率20 mW，CCD取谱时间10 s的测量条件下，未导入银纳米粒子的C666细胞难以测得拉曼信号。5 ul银胶浓度组同样难以获取拉曼信号，说明5 ul银胶与细胞均匀混合于500 ul的电击液中，经过两次电穿孔后进入细胞的银纳米粒子数量少，聚集程度低，未起到增强效果。在10 l银胶浓度组中测得的谱线中出现了一些SERS谱峰，但是光谱信噪比较差。在25 l银胶浓度组中，出现更多的SERS谱

11、峰，光谱的信噪比有所改善。说明随着银胶浓度增加，进入细胞内的银纳米粒子数量和聚集程度有所提高。在50 l、75 l和100 l银胶浓度组中，测量的细胞都能获取信噪比很好的SERS光谱。这说明细胞周围银胶增加到一定浓度后，在两次875 V/cm，1 ms电脉冲作用下，有足量银纳米粒子通过细胞膜上由电脉冲刺激而产生的孔洞进入到细胞内部，滞留聚集成簇，对细胞内SERS测量起到很好的表面增强作用。拉曼光谱强度积分值的大小直接反映了拉曼谱峰强度高低和SERS增强效果，我们通过强度积分值分布统计图来比较不同银胶浓度电穿孔后SERS增强效果。对于每一条细胞光谱，计算谱线下方400 cm-11800 cm-1

12、所包围面积的积分值（即为光谱的强度积分值）。对照组和六个银胶浓度组，均计算并统计测得的三十条光谱的强度积分值，形成强度积分值统计图（图2B）。图中序号5，10，25，50，75，100 l 分别代表六个银胶浓度组，Ctrl为对照组（电穿孔时不加银胶）。对照组中C666细胞难以测得拉曼信号，光谱强度积分值很低。5 l的银胶浓度组细胞光谱强度积分值与对照组相比没有改善。10 l银胶浓度组随机测量的三十个细胞中，有三个细胞出现了较高的光谱强度积分值，说明这三个细胞测得信噪比较好的SERS光谱。低浓度银胶电穿孔后只有个别细胞获得增强效果，可能是由于不同细胞个体活性不同，且细胞膜电穿孔具有不对称性10，

13、电穿孔过程中，细胞膜上出现的孔洞大小不一，恢复时间不同，从而导致电穿孔后细胞内一些部位银纳米粒子聚集较多而一些部位聚集较少甚至没有。而银纳米粒子聚集和吸附程度对拉曼信号表面增强作用影响很大11,12，在银胶浓度较低时，只有进入细胞的银纳米粒子聚集成簇才能起到较好的表面增强作用。在25 l银胶浓度组中，半数细胞测得信噪比较好的SERS光谱，光谱强度积分值的数据分布中心位置相对于对照组及5 l和10 l 浓度组有所提高。在50 l、75 l和100 l的银胶浓度组中，每组三十个细胞都有很高的光谱强度积分值，这些银胶浓度组电穿孔后都获得信噪比很好的细胞内SERS光谱。SERS光谱强度积分值数据分布中

14、心位置随着银胶浓度增加而提高，说明增加银胶浓度可以提高SERS增强效果。50 l、75 l和100 l银胶浓度组都能测得很好的SERS谱线，但是随着银胶浓度增加，光谱强度积分值离散度也逐渐增大。因此我们通过SERS光谱平均谱线来对比这三种银胶浓度电穿孔后细胞SERS光谱的重复性。每组三十条谱线均面积归一化后计算平均谱和标准差，形成平均光谱如图2C所示。随着银胶浓度增大，50 l、75 l和100 l三个银胶浓度组平均谱线的标准差（图2C中谱线的阴影部分）也增大。说明银胶浓度增加，SERS谱线重复性下降。这可能是由于大浓度银胶带来显著的SERS增强效果，而SERS对物质成分细微差别的高灵敏度造成

15、不同细胞个体之间SERS谱线差异。此外，随着银纳米粒子数量和聚集程度增加，增强拉曼信号同时也带来SERS特有的光谱“闪烁”现象（Blinking effect)5,13。因此，在这六个不同银胶浓度组中，500 l电击缓冲液中含有50 l银胶电穿孔后测量细胞内SERS效果最好。与75 l及100 l银胶浓度组相比，50 l银胶浓度组不仅可以测得信噪比很好的细胞内SERS信号，而且重复性更好。此外，减少银胶浓度也减少了纳米银对细胞活性杀伤作用。使用小浓度银胶在电穿孔后也更易于清洗细胞外的银纳米粒子，使实验结果更加准确。2.3 C666细胞内SERS光谱将50 l银胶浓度组中测得的三十条SERS光谱

16、取平均值以获取平均SERS光谱，如图3所示。电穿孔将银纳米粒子导入细胞内作为SERS增强基底，因此测得了丰富的细胞内生化物质SERS光谱。谱峰初步归属见表114-20。3 结论采用首次研发的电穿孔-SERS技术，在成功实现对鼻咽癌细胞C666的SERS光谱探测基础上，研究不同浓度银胶电穿孔后C666细胞内SERS光谱。在穿孔脉冲电场强度875 V/cm，脉冲持续时间1 ms，电穿孔两次的条件下，每500 l电击缓冲液中含有50 l银胶测得的细胞内SERS信号信噪比好且光谱具有较好的重复性。银胶浓度增多在增强光谱信号的同时会导致光谱重复性下降。对活性C666细胞内SERS光谱进行初步谱峰归属。通

17、过优化电穿孔实验中使用的银胶浓度，可以提高电穿孔-SERS效果，获取信噪比和重复性都很好的细胞内SERS信号，从而可使电穿孔-SERS光谱快速分析技术在生物医学领域获得重要应用。References：1 ZHU Zi-ying, GU Ren-ao, LU Iianhong（朱自莹，顾仁敖，陆天虹）. Spectroscopy and Spectral Analysis（光谱学与光谱分析）, 1993, 12(1): 4782.2 LUO Zhi-xun, FANG Yan（骆智训，方炎）. Spectroscopy and Spectral Analysis（光谱学与光谱分析）, 2006,

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25、isible-NIR absorption spectra of pure silver colloid. The inserted picture shows the TEM micrograph of Ag colloidal surface.图2. (A)对照组(不加银胶)及六个不同银胶浓度组(每500l电击缓冲液中含银胶浓度分别为：5, 10, 25, 50, 75, 100 l）电穿孔后细胞内SERS光谱。(B)光谱强度积分统计图。(C) 50, 75, 100l银胶浓度组的平均SERS光谱。Fig.2 SERS spectra (A) and the integrated SERS

26、 intensity (B) obtained from control experiment (electroporation without silver colloid) and six electroporation experiments of the same electroporation parameters (875 V/cm, 1 ms pulse width pulses for two times), but different doses of silver colloid: 5, 10, 25, 50, 75, 100l per 500l electroporati

27、on buffer. Comparison of the mean spectrum for 50, 75, 100l. The shaded areas represent the standard deviations of the means (C). 图3 电穿孔后活性C666细胞平均表面增强拉曼光谱Fig.3 The averaged SERS spectra of living C666 cell after electroporation表1 C666鼻咽癌细胞电穿孔后SERS光谱的谱峰位置和初步归属14-20Tab.1 SERS peak positions and tenta

28、tive vibrational mode assignment峰位置/cm-1振动模式归属5706617278098229099711003102812921343138414271606平面外环变形RNA骨架振动环拉伸振动O-P-O拉伸振动O-P-O拉伸振动CO 拉伸振动C-C对称呼吸振动C-N 拉伸振动CH3,CH2变形振动CH2变形振动CH3对称变形环拉伸振动C=C 拉伸振动腺嘌呤，尿嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶14鸟嘌呤, 胸腺嘧啶, 络氨酸15腺嘌呤，辅酶A14,16磷酸盐14,17络氨酸18磷酸核糖，氨基酸，胺14,17磷酸核糖14苯丙氨酸15,17,19,20苯丙氨酸15,16蛋白，脂类，氨基化合物III17,18核苷酸链19,20核苷酸链, 蛋白，脂类14,16,17腺嘌呤，鸟嘌呤14,15,17络氨酸，苯丙氨酸15,18