蛋白类药物生产.docx

1、蛋白类药物生产 蛋白类药物生产工艺 蛋白质类药物是生化药物中非常活跃的一个领域，目前的生化产品主要是从动物脏器或组织包括人的血液中分离而得。20世纪70年代后，人们开始应用基因工程技术生产一些蛋白质药物，已实现工业化生产的产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、TNF等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。 第一节 主要蛋白质类药物的制备 蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式包括对机体各系统和细胞生长的调节、被动免疫、替代疗法等。一、蛋白质激素类 蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、促

2、性腺激素和其他蛋白质激素。其中垂体蛋白质激素包括 生长素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲状腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等。促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。(一) 生长素(growthhormone，GH)生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。人生长素（human growth hormone，hGH）由一条191个氨基酸的多肽构成的一链多肽的球形蛋白质，分子中含两条二硫键，分子量为21700，等电点4.9

3、，沉降系数S20，W 2.179，其活性不需要整个分子结构，N端1134氨基酸为活性所必需，C端的肽链起到保护作用，其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫性质等都有较大差别。生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。1生长素的传统生产方法 传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图11-1所示。传统的工艺过程如下:材料获取 处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻，-20冷冻保存。预处理 脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。匀浆 取动物垂体前叶，分割成小

4、块，加水，用硫酸铵调pH至5.5，置组织捣碎机中匀浆。提取 对匀浆以水抽提，10 000rpm离心30min；取沉淀，以pH 4.0的0.1molL硫酸铵溶液抽提，离心（同上），取沉淀，再用pH 5.5的0.25molL的硫酸铵溶液抽提，离心，取上清抽提液。沉淀 调节抽提液pH 7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmolL，离心，取上清液。再沉淀 对上清液再加饱和硫酸铵溶液至1.8molL，离心，得沉淀。除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液。等电点沉淀 将所得透析内液用HCL或NaOH分别依次于pH 4.0和pH 4.9进行等电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。盐析

5、 调上清液pH为4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为1.25molL盐析，离心，得沉淀物。除盐 将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含0.1molL氯化钠的Tris-HCL (pH 8.5) 缓冲溶液进行透析，得透析内液。凝胶过滤 透析内液上Sephades G-75凝胶柱，用含0.1 molL氯化钠的50mmolL Tris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性GH存在于第峰中。透析 将活性峰部分对6.5mmolL的硼砂-盐酸(pH 8.7)缓冲溶液进行透析，得透析内液。层析 将透析内液上DEAE-C(DE-52)柱，用含00.3molL氯化钠的6.5mmolL硼砂-盐酸 ( pH

6、 8.0 ) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。2人生长素的基因工程法hGH的种属特异性很强，动物生长激素不能用于人，所以开始时hGH的惟一来源是从人尸体的脑垂体中取得，来源困难，价格昂贵，应用受到限制。目前已利用基因工程技术生产出hGH，美国的Genentech公司利用枯草杆菌系统表达的hGH产量高达1.5g/L，这也是第一代重组人生长激素，商品名称为Protropin.生产路线如图11-2所示。（1）工艺过程如下：工程菌的构建利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列，使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。菌种繁殖采

7、用M9培养基，添加CAA(酪蛋白氨基酸)，调节pH 至70，置于摇床上，30，进行菌种培养繁殖。发酵 培养基同菌种繁殖培养基，种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为1618h，温度为37，pH7.07.5，溶解氧不能低于20%。补料发酵 在发酵进行57 h后，需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐和微量无素，如PO43-、Fe2- 、Co2- 等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期延，发酵菌体产量增加了一倍。其余的发酵条件与上述条件相同，菌体生长至稳定期放罐。离心将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由10 mmol/L Tris和1mmol/L EDTA组成的缓冲溶

8、液（pH 7.5），80rpm搅拌1h，离心，收集上清液。粗提 在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度45%，4放置2h，10000rpm离心30min，收集沉淀。脱盐沉淀用10 mmol/L Tris和1mmol/LEDTA组成的pH值为8.0的缓冲溶液溶解，用Sephadex -G25脱盐。纯化采用Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose进行色谱，再加入固体硫酸铵达到饱和浓度45%，沉淀2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过sephacryl S-11HR及DEAE-Sepharose进行纯化，得到人生长激素原料药半成品.。（2）质量检验：质量必须符合2005年版二部附录规定

9、。目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，重组人生长激素将会得到大规模的生产，从而造福人类。 (二) 胰岛素 ( insulin ) 胰岛素是胰脏中胰岛细胞分泌的一种蛋白质激素，它是促进合成代谢的激素，在调节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用，是维持血糖在正常水平的主要激素之一。广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，占胰脏总质量的1.5。胰岛由、和三种细胞组成，其中细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，细胞制造胰岛素，细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环，能使血糖降低，起到调节血糖

10、作用。临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷和酮症酸中毒、精神分裂症、休克等。胰岛素由A、B两条链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，两链之间由两个二硫键相连，在A链内部含有一个二硫键。不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8位、9位和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上，随种属而异，但其生理功能是相同的。生产胰岛素的方法较多，有传统的方法和基因工程技术方法。1动物胰脏制胰岛素由动物胰脏生产胰岛素的方法较多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。现以酸醇法为例，介绍胰岛素的生产工艺。其工艺路线如图11-3所示。（1）工艺过程如下：

11、 提取 冻胰块用刨胰机刨碎，加入2.32.6倍的8688乙醇(质量分数)和5草酸，在122搅拌提取3h，离心。滤渣再用1倍量6870乙醇和0.4草酸提取2h，离心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰岛素。 碱化、酸化 边搅拌提取液边加入浓氨水调pH 8.08.4 (122)，立即过滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH 3.63.8，降温至5，静置4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。 减压浓缩 吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，取上清液，30以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为1.041.06 (约为原体积的11019为止)。 去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅内，5mi

12、n内加热至50后，立即用冰盐水降温至5，静置34h，分离下层清液 (脂层用于回收胰岛素)。用盐酸调pH 2.32.5，于222搅拌加入27(质量体积分数)固体氯化钠，保温静置数小时。析出物即为胰岛素粗品。 精制 盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4molL氨水调pH 4.24.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为73。充分搅拌后，低温5以下放置过夜，次日在低温下离心分离，取上清夜，在上清夜中加入4molL氨水使pH 6.26.4，加入3.6(体积分数)的醋酸锌溶液(浓度为20)，再用4molL氨水调节pH 6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。 结晶 将

13、沉淀用冷丙酮洗涤，得干品，再按干品质量每克加冷2柠檬酸50mL、6.5醋酸锌溶液2mL、丙酮16mL，并用冰水稀释至100mL，使其充分溶解，5以下，用4molL氨水调pH 8.0，迅速过滤。滤液立即用10柠檬酸溶液调pH 6.0，补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为16。慢速搅拌35h使结晶析出。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜形六面体结晶，再转入5左右低温室放置34d，使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素。（2）质量检验 测定胰岛素效价，各国药典规定有家兔血糖降低法

14、和小鼠血糖降低法。（3）在整个生产过程中，为提高胰岛素的质量和产量，应注意以下几个方面：胰脏质量是胰岛素生产中的关键，在我国是一个薄弱环节。工业生产用的原料主要是猪、牛的胰脏。不同种类和年龄的动物，其胰脏中胰岛素量有所差别，牛胰含量一般高于猪胰。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，并且离体后要立即深冻，先在-30以下急冻后转入-20保存备用，如用液氮速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10。 浓缩 浓缩工序的条件，对胰岛素收率影响很大。如采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，再进行第二次浓缩，被浓缩溶液受热时间极短，避免了胰岛素效价

15、的损失。 产品纯度 在常规的结晶胰岛素中，除了胰岛素主成分外，还含有其他一些杂蛋白抗原成份，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。因此要对结晶胰岛素进一步纯化，胰岛素原的含量显著降低。 2人胰岛素的制备（1）酶促半合成法 猪与人的胰岛素差别仅是B30位上的一个氨基酸，猪的是丙氨酸，人的则是苏氨酸。利用胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30苏氨酸(丁酰基)丁酸，通过硅胶柱层析，然后用三氟乙酸处理，断裂保护基团，再用离子交换层析纯化，得到高纯度人胰岛素。（2）利用基因工程技术制备目前，国际上生产医用重组人胰岛素( recombinant human insulin, rhI)的方法主要

16、有3种:1)用基因工程大肠杆菌( Escherichia coli, E.coli)分别发酵生产人胰岛素( human insulin, hI)的A、B链。然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。这一方法缺点较多,目前已较少使用。2)用基因工程E. coli发酵生产人胰岛素原( human proinsulin, hP I) ,后经加工形成h I。这种方法，E. coli系统表达量高,但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI。3)通过基因工程酵母菌发酵生产

17、hP I,经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少(150 mg/L) ,产量低。工艺生产过程见图11-4。菌种RRhP I/pQE-40 E.coli M15菌株培养基培养基组成为：5g/L 胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5 g/L硫酸铵, 2.5 g/L葡萄糖, 2.7 g/L甘油,100mg/L 氨苄青霉素, 50mg/L卡那霉素, pH 7.2。一次发酵将10 ml经过活化的RRhP I/ pQE-40 E.coliM15转移至100 ml培养基中进行培养, 活化菌种。发酵罐培养将一次发酵液转移至含有1.5

18、 L 培养基的发酵罐中进行发酵罐培养(转速为300 r/min,通气量为11. 511.8) ,一段时间后加入一定量新鲜的培养基并用NaOH 调节pH。在对数生长中期加入0.5mmol /L IPTG并升温诱导RRhPI表达4 h,转速随即调为400500 r /min,增大通气量至11.812.0,继续培养一段时间后,收集菌体。包涵体的收集和洗涤将收集的湿菌体冻存于-20,然后悬浮于缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 5%甘油, 0.10.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 56 ml/g湿菌)中,加入溶菌

19、酶( 5 mg/g湿菌体) ,室温或37振荡2 h。冰浴超声10 s30次,其间每次间隔20 s,功率为200W。10条件下1000 g离心5 min去除细胞碎片。上清液中的包涵体( Inclusion body, IB)在4 条件下27000 g离心15 min收集,然后用含2 mol/L 尿素的缓冲液A充分悬浮,室温静置30 min后4 条件下17000 g离心15 min,收集沉淀。沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮, 4 条件下17000 g离心15min,收集沉淀。最后沉淀用10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.3洗涤两次(4,17000 g离心15 min ) 。

20、RRhPI的初步纯化将收集的IB用含有0.1%0.3%-巯基乙醇的缓冲液B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH 8.0)溶解,上于已用缓冲液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI的洗脱液。RRhPI的重组复性将初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH的50 mmol/L Gly-NaOH重组液,或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0.10.6 mg/ml,收集趋于正确折叠的RRhPI单体组分,加入适量GSH 和GSSG,4放置24 h。酶切转化向RR

21、hPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶, 37酶切一段时间,然后用0.1 mol/L ZnCl2 终止反应并沉淀生成的hI。hI的纯化将0.6g IB分别用含0.1%, 0.2%, 0.3%-巯基乙醇的30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH8.0 溶解,进行DEAE-Sepharose FF 离子交换层析,然后将收集得到的RRhPI组分通过Sephadex G-25脱尿素以使RRhPI复性。二、蛋白质类细胞生长调节因子蛋白质类细胞生长调节因子包括干扰素（IF）、，、白细胞介素1-18 (IL)，神经生长因子（NGF）、肝细胞生长因子(HGF)，血小板衍生的生长因

22、子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(t-PA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白(BMP)等。(一) 干扰素（Interferon ,IFN） 干扰素指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力”，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的作用，是人体防御系统的重要组成。人干扰素根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-)、类淋巴细胞干扰素(IFN-与IFN-的混合物)、成纤维细胞干扰素(IFN-)、T

23、细胞干扰素 (IFN-)等几类。按其抗原性的不同，分为型、型和型三种，同一型别，根据氨基酸序列的差异，又分为许多亚型，如常用的IFN-包括IFN-a、IFN-Ib和IFN-b等亚型。干扰素具有沉降率低，不能透析，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破坏，不被DNase和RNase水解破坏等特性。 干扰素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。 1传统的体外诱生法 传统的方法是通过体外诱生的方法获得干扰素。干扰素具有高度的种属特异性，临床使用的干扰素都用人的细胞制备，-干扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备；-干扰素用人成纤维细胞制备。目前我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法，达到106

24、Umg蛋白的水平。其工艺路线见图11-5。（1）工艺过程如下： 分离灰黄层 取新鲜血液400mL/份，加入ACD抗凝剂，离心，分离出血浆，小心抽取灰黄层。每份血可抽取1315mL，放置4冰箱中过夜。 氯化铵处理 每份灰黄层加入30mL缓冲盐水，再加入9倍体积量的0.83冷氯化铵，混匀，4放置10min，4离心(8000 r/min) 20min。弃上清液，加入适量缓冲盐水，收集沉淀细胞，制备悬浮液，重复上次处理，溶解残存的红细胞。取沉淀的白细胞悬于培养液中，冰浴保存，取样作活细胞计数。启动诱生 于白细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其浓度为100gmL，37水浴搅拌培养2h。正式诱生 启动后的白细

25、胞加入仙台病毒(在10天龄鸡胚中培养4872h，收获尿囊液)使其最后浓度为100150血凝单位mL，在37搅拌培养过夜。仙台病毒诱导人白细胞产生。收集 将培养物离心(2500 r/min) 30min，吸取上清液即得粗制干扰素。纯化 在粗制干扰素中加入硫氰化钾到0.5molL，用盐酸调pH为3.5，离心，得沉淀l。沉淀1加入原体积15量的冷乙醇( 94)，离心，得上清液1。上清液1用盐酸调节pH 5.5，离心弃去沉淀，再调至pH 5.8，离心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原体积150量的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2)溶解，得IFNl。上清液2用NaOH调节pH值至8.0，离心，弃上清液，得沉

26、淀3。沉淀3加原体积150量的0.lmolL PBS和0. 5molL硫氰化钾(pH 8)溶解，pH值降至5.2，离心，得上清液3和沉淀4。 沉淀4加原体积125000量pH 为8.0的0.1molL PBS溶解，调至pH为77.5，对PBS ( pH 7.3)透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-。调节上清液3 pH值为3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积15000量的pH 8.0，0.1molL PBS，加NaOH调节pH 77.5，对PBS ( pH7.3)透析过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-。（2）质量检验 我国用微量板染色的病变抑制法测定。国际上规定，能保护50%

27、细胞免受病毒攻击的浓度即为一个IFN活性单位。 该法特点是一次纯化量大，回收率高于60；经济，简便，易于普及，效价可达1.2108UmL，比活2.2106 Umg(蛋白)。IFN-中干扰素含量占回收干扰素的82，比活也比较高。2基因工程法 随着生物技术的发展，运用基因工程技术，已能在人体外大规模地生产人干扰素即基因工程干扰素。目前，编码干扰素的基因已能在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表达。、三型基因工程干扰素都已研制成功，并投放市场，用于治疗的病种达20多种。我国卫生部已批准生产的干扰素品种有IFN-lb、IFN-a、IFN-b和IFN-r四种。目前，人们在利用蛋白质工程技术研制活性更高

28、，更适于临床应用的干扰素类似物和干扰素杂合体等各种新型干扰素。生产技术路线如图11-6所示。基因工程菌的构建 首先从产生干扰素的白细胞中提取干扰素mRNA，对其进行分级分离。通过蟾蜍卵母细胞找出活性最高的mRNA，并用此mRNA合成cDNA。将cDNA与含四环素和氨苄抗性基因的质粒pBR322重组，转化大肠杆菌K12，得到重组子质粒。对每个重组子用粗提的干扰素mRNA进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到无细胞合成系统中进行翻译。对翻译体系的产物进行干扰素活性检测。再将干扰素的cDNA转入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌在特定条件下进行高效表达。其生产流程如图11-7所示。工程菌

29、的发酵a.种子制备 将构建的基因工程菌传代后于-70下甘油管中保存。如构建的人干扰素-b基因工程菌SW-IFN-abE.coli-DHSa。质粒用PL启动子，含氨苄西林抗性基因。使用时进行活化。b.种子罐培养 将菌种按1种量接种到种子培养基，种子培养基的配方：1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.5NaCl；30摇床培养10h，作为发酵罐种子使用。c.发酵罐培养 发酵培养基的配方：1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.01NH4Cl、0.05NaCl、0.6Na2HP04、0.001CaCl2、0.3KH2P04、0.01MgS04、0.4葡萄糖、50mgmL氨苄西林、少量防泡剂。用15 L发酵罐进行发酵

30、，发酵培养基的装量为10 L，pH 6.8，搅拌500 r/min，通风比为1：1(m3min)，溶氧为50。30发酵8h，然后在42诱导23h完成发酵。同时每隔不同时间取2mL发酵液，在10 000 r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。 在整个发酵过程中，要注意：（1）不同发酵阶段培养基的成分有差异；（2）培养液中要有足够的溶解氧，不同的培养阶段需要的溶解氧量也不同，通常通过增大搅拌速度，增加空气流量或者通入纯氧来满足条件；（3）发酵过程中在不同的阶段应控制不同的pH，发酵后期要降低pH，减少干扰素的水解；（4）要控制适当的温度，既要保证菌体细胞膜的完整和细胞中酶的活性，又要有利于提高干

31、扰素的产量。产物的提取与纯化 a.提取 发酵结束后，冷却，离心(4000 r/min)，30min，收集沉淀，得湿菌体。取湿菌体悬浮于20mmolL 的磷酸缓冲液(pH 7.0)中，冰浴中进行超声破碎，释放干扰素蛋白。4000 r/min离心30min，得沉淀，用含8molL尿素、20mmol磷酸缓冲液(pH 7.0)、0.5mmolL二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌抽提2h，然后15000 r/min离心30min。取上清液，用20mmolL磷酸缓冲液(pH 7.0)稀释至尿素浓度为0.5molL，加二巯基苏糖醇至0.1mmolL，4搅拌15h，15000 r/min离心30min，除去不溶物。上清液经截流量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素b溶液经过SephadexG-50分离，层析柱(2cml00cm)先用20mmolL磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素b部分，经SDS-PAGE检