14蛋白质与氨基酸分析.ppt

1、第十四章 蛋白质与氨基酸分析,Y,第一节 概 述,第一节 概 述,蛋白质测定的方法分类利用蛋白质中含氮进行测定：开氏定氮基本概念：1、蛋白质与粗蛋白质 2、蛋白质系数利用蛋白质的理化性质测定染色反应双缩脲反应萤光反应红外光谱,氮-蛋白质换算系数,第二节 蛋白质的测定,一、常量法新鲜鱼、肉、蛋及含硝态氮较多的蔬菜等样品粗蛋白质的测定（硫酸-催化剂消煮法）植物、动物饲料中粗蛋白质的测定硫酸-催化剂消煮半微量开氏法硫酸-双氧水消煮法纳氏比色法（蒸馏法、比色法，扩散法，电极法测定）方法原理操作过程方法要点问题：1、纯蛋白质如何测定？2、为什么含硝态氮较多的样品必须用硫酸-催化剂消煮？,二、同类种籽中粗

2、蛋白质测定,（一）染料结合法（DBC法）方法原理蛋白质含有一定组成的碱性氨基酸（赖氨酸、精氮酸和组氮酸），其中的 NH2、咪唑基、胍基和蛋白质的末端自由基在pH23缓冲体系中呈阳离子状态，可与偶氮染料（桔黄G、酸性橙12）等结合而沉淀，通过测定染料颜色的降低求出蛋白质的含量。比色波长为482nm.,桔红G,为什么只能直接测定同类种籽中蛋白质的相对量？为什么染料溶液的pH、样品的粒度、振荡反应的时间与温度影响测定结果？为什么称样量应视蛋白质含量而定？普通分光光度计要稀释50倍比色。,问题,染料结合法测定蛋白质含量的影响因素,1、染料浓度对染料结合量的影响从图2中可看出，染料浓度越大，染料的结合量

3、越大。为了减少工作量和降低稀释误差，应采用适宜的染料浓度，以0.04%的染煽动浓度为宜。,2、样品粒度对染料结合量的影响,从图3中可看出，样品粒度越细，蛋白质的碱性基团暴露越多，染料的结合量越大。测定时，所用样品的粒度应基本一致。,3、酸度对染料结合量的影响,从图4中可看出，缓冲液的酸度影响到蛋白质中氨基酸残基所带电荷数。pH越高，其所带的电荷越少减少，染料的结合量越小，吸收A值越大。,4、振荡时间与温度对染料结合量的影响,时间和温度对染料结合量均有影响。温度既可提高反应速度，又可提高反应程度，但提高的程度不大，在5 对实验结果影响不大。在室温下反应2h即可。,（二）双缩脲法,方法原理蛋白质含

4、的肽键含有类似天双缩脲基团（R-CH-CO-NH-CH-CO-R),能起双缩脲反应。即在碱性条件下与铜离子生成紫红色可溶性络合物。蛋白质含肽键多时呈紫色，反之为红色。蛋白质含量在115mg时，其呈色反应符合比耳定律。比色波长为550nm.,方法要点,样品的颜色对测定有影响温度和显色时间要求严格，否则重现性不高。（室温120190min内比色，40时1570min比色）须用6000rpm离心10min以上，才可能澄清比色液。其它同染料结合法。,（三）荧光法,方法原理荧光染料亮磺化黄素与碱性氨基酸络合，生成的络合物在430nm激发光下产生波长为510nm的荧光。荧光强度与碱性氨基酸、蛋白质含量成正

5、比。,操作过程：,120目样品50mg离心管5mL磷酸二氢钠-柠檬酸（pH2.2)5mL 2000rpm离心5min,弃上清液5mL染料，室温振荡1h 2000rpm离心5min,弃上清液（水洗12次）沉淀悬浮于5mL水中进行荧光测定。方法要点。只能测出同类种籽中蛋白质含量的相对量。注意荧光猝灭。其它同染料结合法。,三、植物组织中可溶性蛋白质的测定,（一）斐林酚法（folin-酚法或Lowry法）方法原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜

6、色深浅与蛋白质含量成正比。比色波长为550nm.以小牛血清蛋白质作0250ppm标准曲线。,此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5100g 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。,操作过程,5g鲜样+5mL水研磨g10000rpm离心10min 上清液1mL至试管 5mL斐林试剂 30下10min 0.5mL磷钼酸/磷钨酸 显色10min,650nm比色。,（二）考马斯亮蓝法,方法原理考马斯亮蓝（Comassie brilliant blue

7、)250是一种阴离子染料，在酸性介质中呈橙色，与蛋白质分子内带阳电荷的赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基结合后变为蓝色，最大吸光在465nm，与蛋白质浓度成正比。此显色反应快，约min即可反应完全。生成的复合物约在h内稳定，然后发生聚合并沉淀出来。通过与标准血清蛋白质试样比较可求出样品蛋白质的含量。,本法灵敏度为Lowry 法的4-5 倍，测定范围10-100蛋白质，微量法为1-10蛋白质。此反应重复性好，线性关系好，精确度高。标准曲线在蛋白质浓度较大时可稍有弯曲，但不影响测定。蛋白质与染料结合量不相同，测定与标准蛋白质组成有较大差异的样品时，有一定误差。本法干扰性物质少，少数物质如强碱性缓冲剂、蔗糖

8、、甘油及乙酸等有一些颜色干扰，可用适当对照液消除掉。另如%十二烷基硫酸钠（SDS）等则干扰严重，应避免参入。由于酚类及氨基酸不干扰，使其在测定生物体液或医药品中微量蛋白质时有独特的优点。1976 年提出，现有取代Lowry 法的趋势。,（三）紫外吸收法测定蛋白质含量,方法原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。通过与标准小牛血清蛋白质相比求蛋白质含量。,1在测定工作中，可以利用280nm 及260 nm 的光密度值求出蛋白质的浓度：蛋白

9、质浓度（mg/mL）=1.45OD280nm0.74OD260nm式中：OD280nm 是蛋白质溶液在280nm 下测得 的光密度；OD260nm 是蛋白质溶液在260nm下测得 的光密度。,2对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.22.0之间，选用光程为1cm 的石英比色杯，在280nm 及260nm 处分别测出光密度OD280nm/OD260nm 的比值，从表2 中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F 值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。蛋白质浓度（mg/mL）=FOD280D式中：OD280 为被测溶液在280nm 紫

10、外波长下的光密度，D 为溶液的稀释倍数。,第二节 氨基酸的测定,目前氨基酸的主要测定方法：容量法；比色法；色谱法；薄层层析法；AA分析仪法、HPLC法。荧光法；电化学法；化学发光法；在碱性介质中,谷氨酸对硫氰化钾-鲁米诺化学发光体系有增敏作用。红外光谱法等。,氨基酸分析的一般过程,待测定液的制备游离氨基酸的浸提；全氨基酸组分测定时蛋白质的水解。测定标样的准备；各氨基酸组分的测定,游离氨基酸的浸提,液体试样(包括含CO2或酒精性饮料)直接取样或适量稀释后取样;果蔬试样直接榨汁或用组织捣碎机捣成匀浆，取51g(或ml)于50ml或100ml量瓶内，加30%H2O2 35滴，水稀释至刻度(若溶液浑浊

11、，离心或滤纸过滤)待测定。（有的分析要求用乙醇浸提）,全氨基酸组分测定样品的水解,准确称取样品0.1 0.2g于18 20mm硬质玻璃试管中，加6mol/L HCI及十氢萘1滴。在酒精喷灯上将试管上部34cm处拉成2smm的细颈(如图1所示)。抽真空15min，真空下封管，于110士1水解1618h。水解完成后定容至50mL。静置橙清取清液lmL用Sep-Pack C18预柱滤于50mL烧杯中。在65水浴上蒸干，加两滴去离子水再蒸干，冷却后加25mL 0.02mol/L HCI，然后上机测定。,含硫氨基酸（如胱氨酸和色氨酸）易分解，需专门的水解步骤进行。,氨基酸分析样品水解方法之二,1.一般水

12、解程序取含蛋白质约10mg的量置于水解管6 molL-1 HCl10mL（液体样加等量的浓盐酸）脱气其密封110水解22h水解管开封旋转蒸发器去除盐酸干涸后，用蒸馏水溶解 50以下再次干涸溶于10mL 的柠檬酸钠缓(pH-2)冲溶液中 上机分析。,氨基酸分析样品水解,2.胱氨酸及色氨酸的水解。(1)胱氨酸：将含有胱氨酸 0.251.00 mol的试样溶于88%甲酸10mL 中 取此试样溶液 0.5mL 置于具塞试管中 加入过甲酸溶液(30%H2O2和88%甲酸按溶积19的比例混合，室温下放置1h后使用)2mL 在0下放置4h 旋转蒸发器去除过甲酸用含24%-巯基乙醇的6molL-1 HCl溶液

13、按上步骤水解。(2)色氨酸：取含色氨酸12mg试样聚乙烯管中，将此管封在玻璃管中 加入4.2molL-1 氢氧化钠溶液100mL和 硫代二甘醇0.3mL 脱气封管 110下水解24h 分解物用 6molL-1 HCl 7mL中和再用pH4.2的柠檬酸缓冲溶液调整pH 为4.5，定容至一定量。,氨基酸分析样品水解,3.植物性产品水解取粉碎样2050g 置于最终浓度为750mLL-1乙醇中取10mL均化器均质移入茄形烧瓶中 80加热回流15min 泠却瓷漏斗过滤残渣用75%乙醇50mL再提取两次，滤液合并定容至250mL，在-20下放置一夜有沉淀时，用玻璃过滤器(G-3)过滤或离心分离(6000r

14、min-1，10min)旋转蒸发器去除水分，干涸物溶于试样稀释用的缓冲溶液中。,氨基酸分析仪的一般程序,(1)样品的水解。(2)试样中氨基酸浓度的估量，上机分析氨基酸浓度110nmol/50l范围为宜。(3)分析前的仪器检查：一般有水浴及反应槽的温度，泵的流速，缓冲液，茚三酮试剂以及N2气压力等仪器的各种性能检查。(4)设定分析程序按仪器说明书推荐使用的分析程序操作。(5)分析混合氨基酸标准样层析图谱的各种参数。(6)试样的分析：最后仪器分析试样，打印出全氨基酸的色谱图，以绘出各氨基酸组分的纳克数。然后将按试样的质量，稀释倍数及试样水分系数等，计算其结果。,氨基酸总量的测定甲醛滴定法,方法原理

15、氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们互相作用使氨基酸成中性的内盐。加入甲醛时，NH2与甲醛结合，其碱性消失，这样就可以用酚酞作指示剂，以标准碱来滴定-COOH，用间接的方法测定氨基酸的含量。,甲醛法测定氨基酸的评述,作为定量方法，我国推荐甲醛值法作为标准方法，该法虽有较好准确度，但存在以下间题:方法的灵敏度低，尤其是对饮料中原汁含量较低的样品，往往检不出;对含碳酸型及酒精型的饮料，需除去CO2和乙醇才能测定;滴定终点不易掌握，甲醛浓度滴定速度等要求苛刻;取样量大、分析速度慢、消耗溶剂多。色深样品需用电位滴定等。,氨基酸总量的测定茚三酮比色法,方法原理氨基酸在一定pH条件下与水合茚三

16、酮反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。,氨基酸分析仪法,方法原理：氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相(缓冲溶液)推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时，氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同pH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合物分开，流出色谱柱的氨基酸再与茚三酮在100下反应生成紫色物质茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色后的氨基酸由光度计检测。大多数氨基酸与茚三酮均有此反应，所形成的DYDA在570nm处有最大的吸收峰。但脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm处有一吸收峰，通过光度计对这两个波段的检测，由记录器给出层析图谱，附有数据处理机的氨基酸自动分析仪可直接给出50g样品中含有各种氨基酸的纳克(ng)数。,氨基酸分析仪工作流程,泵,混合器,反应槽,比色计,记录仪,多支管,电磁阀,蛋白质水解物分析用缓冲溶液,水合茚三酮配制表,氨基酸的分离与鉴定薄层层析法,方法原理水解样液滴在微晶纤维板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，由于氨基酸的吸附力和Rf值不同而分离，用茚三酮喷雾显色，与标准氨基酸图谱相比较进行定性和定量。操作：15g