药理周英.docx

1、药理周英抗肝损伤药物实验方法研究进展 药学院 药物化学 周英 2013021161摘要：近年来肝脏疾病对人类的健康和社会的发展造成严重威胁。深入研究和探讨急性肝损伤的发病机制以及治疗措施，对慢性肝脏疾病的防治具有重要意义。本文通过对化学性肝损伤、免疫性肝损伤、酒精性肝损伤、其他损伤、GSTA1等方面文献的搜集、整理、综合分析，提出了应进一步探究更为适合的实验模型。其中急性肝损伤是多种肝脏疾病的发生、发展及最终走向肝功能衰竭的始动环节和共同途径，建立与人类急性肝损伤发展病变过程相似的动物模型极为重要。GSTA1是相结合反应同功酶GST的一个亚型，在抗氧化损伤、抗肿瘤方面具有重要作用，并有可能成为

2、药物研发重要的新方向。现将近年来国内外对实验性肝损伤动物模型分类、作用原理、造模方法及其优缺点等研究进展作综述和探讨。关键词 ：急性肝损伤；化学性肝损伤；免疫性肝损伤；酒精性肝损伤；GSTA11引言我国是肝病高发国家，目前约有2亿人患有各种肝病，其影响面广，对人类的健康和社会的发展构成严重的威胁，肝病作为全球九大引起死亡的疾病之一，已被医学界列为重要研究课题。肝脏是动物体进行代谢的主要场所，各种内源性物质以及摄入的外源性物质均在肝脏内进行重要的化学反应，是动物体重要的合成、代谢和解毒的器官。多种药物、毒物经过肝脏代谢，转换成小分子物质进一步进行吸收或者排泄，某些毒物经过肝脏代谢可分解为无毒或者

3、毒性较小的物质，从而降低毒物对机体的损伤。肝脏在保护机体的同时，又易被各种毒物、药物以及化合物的代谢产物损伤。导致肝损伤的原因有很多，目前主要研究的有化学性肝损伤、酒精性肝损伤、病毒性肝损伤和免疫性肝损伤等1,2。当肝脏发生病理改变时，还会导致全身代谢物、血液循环系统、消化系统、内分泌系统等改变，并影响到内源性小分子代谢物的转归3。近年来养殖业中的急性肝损伤性明显增多，严重威胁着养殖业经济发展和食品安全问题，但仍缺乏行之有效的防治措施4，5，急性肝损伤是多种肝脏疾病的发生、发展及最终走向肝功能衰竭的始动环节和共同途径，目前对急性肝损伤的防治仍是一个全球性的严峻课题。深入研究和探讨急性肝损伤的发

4、病机制以及行之有效的治疗措施，对慢性肝脏疾病的防治具有重要意义。近年来国内外有关肝损伤模型的研究取得了较大进展，但由于肝脏功能复杂性和肝损害因素的多样性，任何一种实验动物模型都不能全面、准确地反应特定肝损伤的本质。此外，现有的动物模型都存一定的局限性，且人多不易操作，不够稳定，剂量各异，方法不统一等缺点，急性肝损伤动物模型还需要进一步完善，肝损伤的机制复染，尚待进一步研究6,7。建立与人类急性肝损伤发展病变过程相似的动物模型极为重要。1化学性肝损伤1.1四氯化碳肝损伤CCl4是一种常用的诱发化学性肝损伤模型的剧毒类化学药物之一，因其接触后发病率高。易在动物实验中复制，能准确反映肝细胞的形态学变

5、化，在研究保肝降酶药的实验中经常使用8。此模型是肝损伤的经典模型，应用最多，能准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化，重复性好。但缺点是CCl4还同时损害动物的其他多种脏器，此外，CCl4挥发性较大，可经人体多种途径吸收，故对实验人员具有一定的中毒危险性。1.2D-半乳糖胺肝损伤D-半乳糖胺（D-GalN），又名D-氨基半乳糖，是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，可造成肝弥漫性坏死和炎症，与临床病毒性肝炎的肝脏病理变化相似。该模型肝脏组织病理学改变和生物化学的变化均与人类病毒性肝炎极为相似，也能发展为肝性脑病，其可逆性和重复性均较好9。而且D-GalN肝毒性的专一性较其他肝毒物较好，对实验人员也

6、无危险。因此，D-GalN性肝损伤模型是目前公认的比较好的研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物的实验动物模型。1.3对乙酰氨基酚肝损伤对乙酰氨基酚(AP)亦名醋氨酚、扑热息痛，是替代阿司匹林的解热镇痛药，大剂量或长期服用时，可导致严重毒性效应，尤以肝脏小叶中央型坏死为常见。AP造成的肝损伤是目前国际上常用的模型。AP为临床常用的解热镇痛药，每日25mg治疗剂量下较安全，AP所致肝损伤，主要导致肝脏对AP代谢能力受限，最终导致肝细胞变性坏死，过量或长期使用可使肝脏产生不同程度的损害，故AP制备的肝损伤模型不及前两模型常用。1.4.其他化学损伤雷公藤多苷片、异烟肼、四环素等所致的肝损伤10。2免

7、疫性肝损伤肝脏内免疫反应是引起病毒性肝损伤的主要机制之一，因此以免疫学机制诱导的肝损伤模型建立，为肝损伤研究开辟了新途径，对研究病毒性肝炎防治具有重要意义。2.1卡介苗加脂多糖诱导法模型的机理在于预先给动物注射卡介苗，可使多核中性粒细胞或巨噬细胞聚集于肝，继后再用脂多糖攻击注射，可激发这些细胞释放对肝细胞有毒性作用的可溶性因子，造成免疫性肝损伤。该动物模型与用化学物质造成的肝损伤模型比较，在病理机致上更接近人体的肝炎。2.2.刀豆蛋白A诱导法刀豆蛋白A（ConA）是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，还能选择性激活抑制性T细胞，对调节机体免疫反应具有重要

8、作用。该模型发病迅速，肝脏损害明显，短期内即可快速地诱导临床和组织学的肝炎。3酒精性肝损伤乙醇及其在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物所引起的代谢紊乱是导致酒精性肝损伤的主要原因11。乙醇所致肝损伤的重要机制之一是激活氧分子产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化。体内依赖性抗氧化系统中以GSH在抵抗酒精所致的肝损伤中起关键作用，酒精在体外和体内均可使肝脏GSH含量显著降低，GSH含量的减少可能是酒精导致肝脏脂质过氧化增强的原因之一12。3.1急性酒精损伤郭科南13等利用急性酒精损伤模型，研究苦碟子注射液对急性肝损伤大鼠的影响，模型组每天禁食不禁水，6h后按7.0ml/kg给大鼠灌胃50%乙醇，1h后

9、重复1次，连续5d。末次造模16h后取血检测。结果发现，模型组大鼠灌胃后出现醉酒症状，大约2h后转醒。较空白组情况差，食欲下降，毛发光泽度差，体重增缓慢；与空白组比较，模型组血清ALT、AST水平均有明显升高，血清GSH含量明显降低，肝匀浆SOD水平明显降低，肝匀浆MDA显著升高。3.2慢性酒精损伤慢性酒精性肝损伤的诊断主要靠病理学检查14。张宇15等通过慢性肝损伤实验，观察茶多酚对该模型所致肝损伤大鼠的影响，模型组以56%体积分数白酒折算成酒精灌胃1次/d，大鼠于灌胃4周末、12周末和24周末称重后，取血处死测指标。结果表明，模型组肝体积增大，质地较空白组粗硬，色泽较暗淡；模型组血清ALT、

10、AST水平均较空白组有明显升高；肝细胞浆出现不同程度的空泡变性，重者胞体肿大气球样变。实验通过不同时间造模，还发现酒精组大鼠肝脏病理检查显示了不同程度的脂肪变性和炎症改变表现。早期以酒精性脂肪肝为主，可见部分大鼠肝小叶中心带部位的肝细胞中出现大小不等的脂肪滴而后期以酒精性肝炎的表现为主，大鼠的肝小叶均可见肝细胞点状或灶状坏死。4.其他损伤4.1.高强度聚焦超声该方法是治疗实体肿瘤如肝癌的一种新方法，其治疗的机理目前尚不完全清楚，可能与聚焦超声在体内产生的高热效应、空化效应和机械效应及对肿瘤血管的破坏有关16。4.2镉 镉是环境中广泛存在的重金属毒物之一，急性镉暴露可以损害机体多种靶器官组织，如

11、肾脏和肝脏等。镉对肝、肾的损害与氧化损伤、氧化应激密切相关17。镉致急性肝损伤与镉诱导的氧化应激，从而引发的自由基损伤密切相关18。5 GSTA1研究进展5.1 GST功能与分类谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-Transferase， GST)是广泛存在于动植物体内的参与体内生物转化II相结合反应的同功酶系。GST是细胞防御系统的重要組成部分，可保护机体免受亲电活性物质的攻击，防御多种内源性和外源性毒物。GST同工酶存在两个超基因家族，细胞溶质GST (或可溶GST)和微粒体GST (Microsomal GST， mGST)。微粒体GST现归于类花生酸类物质和GSH代谢膜相关蛋

12、白(Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione Metabolism， MAPEG)的一个新的超家族19。主要参与花生四稀酸代谢，在白三稀和前列胞素的内源性代谢中发挥重要作用。细胞溶质GST超家族，为二聚体酶，主要参与有毒异生物质和内源性物质代谢，根据氨基酸序列同源性以及底物特异性，将GST分为Alpha (GSTA)， KaPPa (GSTK)， Mu (GSTM)， Pi (GSTP)， Sigma (GSTS)，Theta (GSTT)，Zeta (GSTZ)和Omega (GSTO) 8个家族20。药物代谢是细胞

13、解机制中重要的组成部分，这一过程中主要涉及到两种酶:I相药物代谢酶和II相药物代谢酶，GST酶系是II相药物代谢反应的关键酶。生物体内II相结合反应是真正的解毒途径，此反应将药物及其代谢物与内源性物质结合后，形成水溶性更强的终排泄物，随尿液或胆汁排出体外，包括糖苷结合、硫酸化、甲基化、乙酰化、氨基酸结合21。GST的功能是减少GSH的酸解离常数，催化GSH与亲电底物相结合，或以非酶结合方式将体内各种潜在毒性化合物及亲脂性化合物从体内排出，防止生物转化中形成的活性中间产物与生物大分子共价结合，以达到解毒的目的。GST活性以及表达量的变化与细胞保护作用、药物代谢、肿瘤耐药密切相关22，23。5.2

14、 GSTA1功能GSTA1的功能之一是作为肝损伤标记物。目前使较多的传统肝损伤标记物是血清转氨酶，包括ALT和AST。ALT主要分布于肝细胞浆中，AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中，作为肝细胞内酶，在氨基酸的合成与分解代谢中起重要作用。正常情况下只有极少量释放入血液，当肝组织受到急性损伤成细胞膜通透性增加时，这两种酶大量释放到血液中，使血清中酶活性显著增高。但是，AST在心脏、骨骼肌、肾脏、胰腺和红细胞病变，尤其是在溶血性疾病时浓度均升高，因此它是一个非特异性标记物。ALT有较高肝脏特异性，但半衰期较长。据报道，GSTA1半袞期较短，约为1 h，GSTA1浓度升高先于 ALT几个小时，

15、肝损伤的恢复期，与ALT活性比较，GSTA1浓度迅速下降24。在检测转氨酶活性时，溶血会影响所检测指标的准确度，并增加试验量，由于 GSTA1在红细胞中不表达，所以样本溶血不影响GSTA1含量的检测，增加了 GSTA1的准确度。GSTA1主要分布于肝细胞小叶中心，研究发现先兆子痫病，ALT和GSTA1含量的共同测定，比单独测定ALT，更能显示肝细胞损害的证据25。在急性肝细胞损害的各种疾病，如急性病毒性、中毒性和药物引起的肝炎和缺氧引起的肝损害26-28可检测到GSTA1的升高。因此，明确在急性肝损伤时GSTA1的变化及意义，对于肝损伤的早期诊断以及治疗有重要的意义，并有可能为研究肝损伤机理和

16、药物筛选提供更可靠地数据。5.3 GSTA1的研究目的与意义我国是肝病高发国家，肝脏疾病对人类的健康已构成严重威胁，给养殖业造成巨大经济损失，同时带来食品安全等话多问题。急性肝损伤是多种肝脏疾病的发生、发展及最终走向肝功能衰端的始动环节和共同途径，深入研究和探讨急性肝损伤的发病机制以及行之有效的治疗措施，对慢性肝脏疾病的防治具有重要意义。由于肝脏功能复杂性和肝损害因素的多样性，任何一种实验动物模型都不能全面、准确地反应特定肝损伤的本质。此外，现有的动物模艰都有一定的局限性，且大多不易操作，不够稳定，剂量各异、方法不统一等缺点，急性肝损伤动物模型还需要进一步完善，肝损伤的机制复杂，尚待进一步研究

17、。药物代谢是细胞解鸾机制中重要的组成部分，这一过程中主要涉及到两种I相药物代谢酏和II相药物代谢酶，GST酶系是II相药物代谢反应的关键酶。GST是细胞防御系统的重要组成部分，可保护机体免受亲电活性物质的攻击，防御多种内源性和外源性毒物。GSTAI是GST的一个亚型，约占人类肝脏总GST的65-75%。GSTA1是谷胱甘肽结合反应的关键酶，可以催化亲核性的谷胱甘肽与各种亲电子外源化学物质的结合反应，促进有毒物质在细胞内降解清除，保护机体。已有研究发现，在引起急性肝损伤的疾病中可检测到GSTA1升高，这提示我们GSTA1对于肝损伤的早期诊断以及治疗可能具有重要的意义。已有研究发现缺少GSTA1蛋

18、白可能增加肝脏癌症的敏感性，且目前人多数GST诱导剂可作为抗癌药物，这提示我们GSTA1可能具有重要的抗肿瘤作用，并有可能成为药物研发重要的新方向。综上所述，虽然近几年来国内外有关肝损伤模型的研究取得了很大进展，但是对肝损伤的防治仍是一个严峻课题。接下来我们可以通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有十分重要的现实意义。参考文献：1 KING P, PERRY M. Hepatotoxicity of Chemotherapy J .The Oncologist, 2001, 6:162-176.2 YE JF, ZHU H, ZHOU ZF, e

19、t al. Protective mechanism of andrographolide against carbon tetrarch- loride induced acute liver injury in mice J, Biol Pharm Bull, 2011,34(11):1666-1670.3 STARLEY BQ, CALCAGNO CJ, HARRISON SA, et al. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellu- larcarcinoma: a weighty connection J .Hepatology

20、, 2010,51(5):1820-1832.4 WANG WN, YANG XB, LIU HZ, et al. Effect of Oenanthe javanica flavone on human and duck hepatitis B virus infection J .Acta Pharmacol Sin, 2005,26(5):587-592.5 LEFKOWITCH JH. Morphology of alcoholic liver disease J .Clin Liver Dis, 2005,9(1):37-53.6张琪,陈辉,彭顺利,等.急性肝损伤动物模型制备研究进展

21、J.吉林医药学院学报,2011,32(4):216-220.7 LIONG EC, XIAO J, LAU TY, et al. Cyclooxygenase inhibitors protectd-galactos- amine/lipopolysaccharide induced acute hepatic injury in experimental mice model J .Food ChemToxicol, 2011,50(3-4):861-866.8 Lesage G D, Benedetti A, Glaser S, et al. Acute carbon tetrachlor

22、ide feeding selectively damages large, but not small，cholangiocytes from normal rat liver J. Hepatology,1999，29(2)：307-319.9何萍,黄仁彬,林军等乙肝转阴散对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用J.广西医科大学学报,2006,23(5):732-733.10 禄保平,彭勃,等. 保肝解毒颗粒对3种急性肝损伤模型小鼠IL-18及细胞凋亡影响的比较J. 新中医,2009,41(9): 96-98.11 曲海波,宗建成,王海苹,等. 乌丹醒肝颗粒对大鼠急性酒精性肝损伤的影响J. 齐鲁

23、药事,2006,25(12) : 757. 12 王宪龄,卢依平. 柴胡黄芩配伍抗大鼠急性酒精性肝损伤作用研究J. 中药药理与临床, 2005, 21 (4) : 10.13 郭科男,钱宁,董小君,等. 苦碟子注射液对乙醇所致大鼠急性肝损伤的影响J. 时珍国医国药,2009,20(3): 543-544. 14 周淑琴,贾从义,高殿生,等. 实验性酒精中毒对大鼠肝脏损伤的病理形态学观察J. 中华病理学杂志,1986 ,15:136-139. 15 张宇,陈绍华,等. 茶多酚治疗慢性酒精性肝损伤的实验研究J. 中华肝脏病杂志,2005,13(2): 125-127.19 Rowland U ,

24、Rivens I , Chen L , et al. MRI study of hepatictumours following high intensity focused ultrasound surgery. Br J Radiol ,1997 , 70 :144-153. 20 Shaikn Z A, Vu T T, Zaman K. Oxidative stress as a mechanism of chronic cadmium induced hepatotoxicity and renal toxicity and prevention by antioxidants J .

25、 Toxicol Ap- pl Pharmacol, 1999, 154 (3): 256-263. 21 Bucio L, Souza V, Albores A, et al. Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL268 cell) J . Toxicology, 1995, 102: 285-299.19JAKOBSSON P J, MORGENSTERN R, MANCINI J, et al. Common structural features of MAPEG-a widesprea

26、d superfamily of membrane associated proteins with highly divergent functions in eicosanoid and glutathione metabolism J. Protein Sci, 1999, 8(3):689-692.20JAKOBSSON P-J, THOREN S, MORGENSTERN R, et al. Identification of human prostaglandin E synthase: A microsomal, glutathione-dependent,inducible e

27、nzyme,constituting a potential novel drug target J. Proc Natl Acad Sci USA. 1999,96(13):7220-722521CHEN Y, JI LL, LIU TY, WANG ZT. Evaluation of gender-related differences in various oxidative stress enzymes in mice J. Chin J Physiol. 2011, 31,54(6):385-390.22SONG YN, GUO XL, ZHENG BB, et al. Ligust

28、razine derivate DLJ14 reduces multidrug resistance of K562/A02 cells by modulating GST activity J. Toxicol In Vitro. 2011,25(4):937-943.23 KILBURN L, OKCU MF, WANG T, et al. Glutathione S-transferase polymorphisms are associated with survival in anaplastic glioma patients J. Cancer. 2010, 1,116(9):2

29、242-224924 CHOUKER A, MARTIGNONI A, SCHAUER RJ, et al. a-Gluthathione S-Transferase as an early marker of hepatic ischemia/reperfusion injury after liver resection J. World J.Surg.2005, 29:528-53425 KUMTEPE Y, BOREK(I B,AKSOY H, et al. Measurement of plasma glutathione S-transferase in hepatocellula

30、r damage in pre-eclampsia J .J Int Med Res.2002,30(5):483-487.26 MULDER TP,JANSSENS AR, DE BRUIN WC,et al. Plasma glutathione S-transferase alpha 1-1 levels in patients with chronic liver disorders J .Clin Chim Acta. 1997 , 258(1):69-77.27 HEIJNE WH, SLITT AL, VAN BLADEREN PJ, et al. Bromobenzene-in

31、duced hepatotoxicity at the transcriptome level J .Toxicol Sci. 2004,79(2):411-422.28 SILVANTO M, MUNSTERHJELM E, SAVOLAINEN S, et al. Effect of 3 g of intravenous paracetamol on post-operative analgesia, platelet function and liver enzymes in patients undergoing tonsillectomy under local anaesthesia J .Acta Anaesthesiol Scand. 2007,51(9):1147-1154.