植物细胞工程实验 修改版.docx

1、植物细胞工程实验 修改版植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。二、实验器材电子天平（称量为0.0001g）、电子天平（称量为0.01g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、细口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、药勺、玻璃棒、电炉。三、实验药品NH4NO3、KNO3、CaC

2、l22H2O、MgSO47H2O、KH2PO4、KI、 H3BO3、 MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、 Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O、FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸。四、实验步骤每种母液均配制500ml，各成分的质量如下：1、大量元素母液的配制表1 MS培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度（mg/L）扩大20称量(mg)备注1NH4NO3165016500蒸馏水定容至500ml2KNO31900190003CaCl22H2O44044004MgSO47H2

3、O37037005KH2PO41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到500ml的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液50ml。注意：配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一

4、、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。CaCl22H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl22H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO45H2O、CoCl26H2O。按照表2配方，用称感量为0.0001g的电子天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1 L培养基，取微量母液5ml。表2 MS培养基微量元素母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1Mn

5、SO44H2O22.322302ZnSO47H2O8.68603H3BO36.26204KI0.84845Na2MoO42H2O0.25256CuSO45H2O0.0252.57CoCl26H2O0.0252.5注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液5ml。表3 MS

6、铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1Na2-EDTA 37.337302FeSO47H2O27.82780注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独

7、配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子天平。注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是：配制母液时用无菌双蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。表4 MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1甘氨酸22002肌醇100100003盐酸硫胺素(VB1)0.1104盐酸吡哆素(VB6)0.5505烟酸0.5505、激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg

8、/ml为好，需要注意的是：配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加34滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都应保存在04冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。五、思考题：1、配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl22H2O时，为什么要将蒸馏水加热？2、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。培养基配方：

9、MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。表5 按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表药品名称母液浓度1L培养基母液吸取量0.3L培养基母液吸取量大量元素20倍液微量元素200倍液铁盐200倍液有机物质200倍液6-BA0.5mg/mlKT0.5mg/mlNAA0.5mg/ml蔗糖琼脂PH值5.8实验二 培养基的配制与灭菌一、实验目的与意义学习培养基配制与灭菌的操作方法。对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状

10、态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。二、实验器材电子天平、烧杯（1000ml）、医用搪瓷量杯（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。三、实验药品蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。四、实验步骤（一）、培养基配制（以1L MS培养基为例）1、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）1000 ml/母液浓度（mg/L）。2、移液取1000ml瓷杯一只

11、，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷缸中备用。注意：在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错；移液管不能混用。3、称取称取7g琼脂，30g蔗糖备用4、融化用搪瓷杯量取600的蒸馏水放在电炉上，煮沸，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加水定容至800ml,加入蔗糖，定容至1000ml，煮沸。注意：加琼脂

12、的时候要边加入边搅拌，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。5、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.20.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5个单位左右，所以我们调PH值时一般要求培养基常温PH值在5

13、.8-6.3之间，我们可以适当上调至6.3-6.4，以确保培养基的凝固)。注意：调配时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。7、分装溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1L培养基，可分装2530瓶。8、包扎用封口膜封口，扎好绳子，用记号笔做好标记注意：培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5

14、.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量，。（二）培养基的灭菌培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指

15、针移至1.11.2kg/cm2时，即121时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。取出培养基，待培养基自然冷却凝固。放置1 d后再使用。表1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间容器的体积(ml)在121下最少灭菌时间(min)205015751502025050025100030150035200040表2 饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力kg/cm2 磅/平方英寸 温度饱和蒸汽压力kg/cm2 磅/平方英寸 温度0.001001.05515121.00.1412103.61.12516122.00.2814106.91.26

16、618124.10.4426109.81.40620126.00.5638112.61.54322127.80.70310115.21.68124129.60.84412117.630134.50.98414119.950147.6注意：锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。对蒸馏水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压力也要提高，一般在126维持一个小时。另外三角瓶中的液体不超过总体积

17、的70%，否则当温度超过100时，培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置24-72h。放置后如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。另外做好的培养基一般应在1-2周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4条件下。2、过滤除菌培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中可能会降解。这类物质需要进行过滤灭菌。例如一些生长因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基的其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40，再将过滤

18、灭菌后的该化合物按计划用量依次加入，摇匀，凝固后即可使用。如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再加入。除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于0.4m。过滤灭菌的原理，是溶液通过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。滤膜的吸附作用力也不容忽视，往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置。液量少时可用注射过滤器，它由注射器、滤器(可更换)、持着部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好，最好放在有螺旋盖的玻璃罐中，经高压灭菌，滤器灭菌不应超过121。由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用，

19、在液量多时多用几套这种装置(亦可适当重复使用)也能顺利完成液体灭菌操作。在使用前按无菌操作要求将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起，把吸有需要过滤灭菌溶液的注射器插入细菌过滤器与之相配合的插接口，推压注射器活塞杆，将溶液压过滤膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了，但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过。在一般情况下，人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒。更严格的实验研究中，这一点仍不容忽视。毫无疑问，过滤灭菌过的溶液要按无菌操作要求尽快加入培养基中，以免重新遭到污染。实验三 培养材料灭菌和接种一、实验目的与意义培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验，领会无菌培养对实验材料消毒

20、，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作技术。二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。三、实验药品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根、绿豆种子、培养基母液。四、实验步骤1、准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。2、将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25min，然后关室内的紫外灯，开通风开关，关闭台内的紫外灯，通风10min后，再开日光灯进行无菌操作。3、接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。4、将绿豆种子在流水下冲洗干净。5

21、、将种子放于200ml的广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液（加入吐温2滴）浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5次备用。6、解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。7、接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。8、在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口（接种时用左手托住三角瓶，呈斜向上方45度这样既有利于，将外

22、植体方便的送入培养基中，还能有效防止细菌落入三角瓶内，如果瓶口直立朝上，可能会导致大量的细菌落入三角瓶内，但如果三角横放可能会导致液体培养基流到瓶口，甚至流出，增加染菌几率。右手握住镊子，注意镊子的拿法。用酒精灯外焰灼烧三角瓶瓶口和瓶壁，使瓶口和瓶壁的细菌灼烧死亡。）左手持瓶，使其靠近火焰，在接种的过程中瓶口始终不能离酒精灯太远，右手将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放4-6个外植体。9、转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好绳子，标上接种日期、材料名称、姓名等。10、将接种材料移到培养室培养

23、。注意：（1）从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。（2）外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素，最好选用两种消毒剂交替浸泡，初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂见表1。（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。（4）接种前培养基出现大量污染现象，若菌类只存在于培养基表面，且主要是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净，菌类

24、种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。另外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的原因。避免此现象发生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀，此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净工作台开启15-

25、20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-15 min，自来水冲洗0.5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温-80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。表1 植物组织培养中常用的消毒剂消毒剂名称使用浓度（%）消毒难易灭菌时间（min）消毒效果乙醇7075易0.13好氯化汞0.10.2较难215最好漂白粉饱和溶液

26、易530很好次氯酸钙910易530很好次氯酸钠2易530很好过氧化氢1012最易515好五、思考题1、接种后污染调查观察：接种后25天的污染情况，填入下表：观察日期接种日期接种数污染数污染率主要污染菌种注：污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）100如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒时间适宜。2、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？有时候会在消毒溶液中加入12滴的表面活性物质，例如吐温-80或吐温-20，为什么？3、在接种过程中，

27、通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？4、对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？实验四 胡萝卜愈伤组织的诱导与增殖一、实验目的与意义学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、培养皿三、实验药品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根、培养基母液、2，4-D、水解酪蛋白（CH）。四、实验步骤1、培养基配置诱导胡萝卜愈伤组织的培养基为：MS

28、+2，4-D 1.5mg/L+ 6-BA0.5 mg/L + 3%蔗糖+0.7%琼脂,pH 5.8。愈伤组织增殖培养基：MS+2，4-D 0.5mg/L+CH 500mg/L + 3%蔗糖+0.7%琼脂,pH 5.8。将配好的培养基，高温蒸汽灭菌之后，冷却，在室内观察1-2天，如不生长细菌则表明灭菌测底，再将这些培养基转入无菌操作台内，紫外照射30mins以上。2、胡萝卜营养根的消毒。将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织。将胡萝卜切段，每段厚约0.5-1cm。把胡萝卜段用无菌水漂洗干净。用75%的酒精溶液浸泡30s。用0.1%氯化汞浸泡2、5、10、12min，在浸泡过程中用镊子

29、搅拌，以使消毒充分。这里设置梯度是为了探究最佳的升汞消毒时间，我们直接采用的是10mins 的消毒时间。浸泡过的胡萝卜段用无菌水冲洗3-5次，洗去残留的氯化汞残留液。3、解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。4、胡萝卜营养根切片胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分。在切片消毒之前首先除去皮层的最外层，以减少胡萝卜营养根的带菌量。形成层的分生能力最强，是产生愈伤组织的主要部分，因此在切片时应使每一个切片上都有形成层。具体操作方法和步骤如下：胡萝卜的截面图 沿图中竖线切开 沿图中竖线切成首先沿横线把胡萝卜段切开 两边部分弃去（如图） 切片，每片厚0.5-1mm 图1 胡萝卜营养根切片的制作注意：消毒以后的所有操作过程，都应在超净工作台上进行，操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后再切割。5、轻轻打开封口膜，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌，同时把长镊子也放在火焰上方灼烧，将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝，用镊子取出切好的胡萝卜切片放到培养基表面，用镊子轻轻向下按一下，使切片部分进入培养基。在酒精灯火焰上转