02 菌种选育.docx

1、02 菌种选育02 菌种选育本章内容：1、菌种的来源2、诱变育种3、抗噬菌体菌株的选育4、杂交育种5、原生质体融合技术6、菌种保藏第一节 菌种的来源2.1.1 生物物质产生菌的筛选2.1.1.1 M生物产物的来源M是各种生物活性产物的丰富资源，要获得所需生物特性的新产物，关键是：、选择M；、筛选方案(检测系统)。M细胞内含物及其培养基成分极其复杂，且所需的产物可能每毫升只有微克到毫克，在选择筛选方法时必须考虑选择性和灵敏度两个方面，即需灵敏度很高的专一性检测方法。2.1.1.2 待筛选样品的性质寻找新产物的产生菌可用固体或液体培养基筛选。但次级代谢物的大规模生产是用沉没培养法进行的，由于在固体

2、培养基和液体培养基中产生的次级代谢物的方式不一样，因此有些研究人员以液体培养法为惟一的筛选手段。2.1.1.3 筛选方案的设计基本上可利用以下三种不同的筛选方法：、整体生物；、完整细胞；、亚细胞制剂。2.1.2 M选择性分离的原理和方法大多数抗生素均由放线菌产生。下面介绍放线菌为主的分离方法原理的发展。选择性分离方法大致可分为五个步骤：、含M材料的选择；、材料预处理；、所需菌种分离；、菌种培养；、菌种选择和纯化。以上任何一个阶段都可引人选择压力。 2.1.2.1 含M材料的选择在选择菌种来源时，存在一些选择标准。对于天然材料，如土壤的选择，来源越是广泛的样品，含有目的类型的M的可能性越大，获得

3、新菌种的可能性越高；另一方面，可寻找已适应相当苛刻的环境压力的M类群。这种方法已获得某些成功(见表2-1)。从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌(Actinopolyspora halophila)，从盐场分离出嗜盐链霉菌，说明在富盐环境中存在一类尚待开发的放线菌。 酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的放线菌类群有很大不同。因此，也有可能利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。自然环境的菌群可因人类的活动而改变。于土壤中加入去莠津(atrazine)会导致放线菌菌群数量的增加。如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂中。更新的生态环境仍有待开发。例如，有人从

4、Componia的根瘤中分离出一株放线菌，并从白蚁的肠子里分离出一株类似放线菌的细菌。但迄今仍很少有人从厌氧M中筛选次级代谢产物。2.1.2.2 材料的预处理材料预处理可提高菌种分离效果，包括物理、化学与诱饵法（表2-2）。（1）、物理法加热、过滤、离心等。举例：A 热处理 可减少材料中的细菌数。因许多放线菌 (如红球菌Rhodococcus)比G-细菌细胞耐热。B 膜滤法 样品中细胞数较少时(如水)，可采用膜滤法浓缩样品中细胞。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响。处理放线菌繁殖体含量很低的海水，可先将样品离心后再过滤。C 其他 收集腐烂稻草和其他植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行

5、。并可用一风筒或一简单的沉淀室收集孢子。然后，用Anderson取样器将空气撞击在含培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的细菌数目。（2）化学法在分离前加一些固体基质(把几种基质加在土壤中)或洒些可溶性养分来强化培养基。（3）诱饵技术将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。举例：有人曾广泛使用石蜡棒技术来分离诺卡氏菌；用各种诱饵法从土壤中分离耐酸放线菌，游动放线菌科的某些属产生的游动孢子。有人用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌，其中有些是新种或亚种。2.1.2.3 所需菌种的分离方法：选择合适分离培养基、pH和选择性抑制剂。1、选择合适的分离培养基：表2-3列举了分离放线菌

6、的各种培养基配方。一般凭经验而不是绝对性选择。其中广泛应用的是几丁质、淀粉-酪素和M3琼脂三种培养基。几丁质培养基：分离土壤和水中放线菌。但测试过的500株链霉菌和其他放线菌中，只有25的菌种具有强的水解几丁质的能力。许多放线菌生长在能利用几丁质的可作为放线菌碳与氮源的“食腐菌”上，而其本身却不利用几丁质。淀粉-酪素培养基：长出的放线菌种类与几丁质培养基上生长的相似，但其菌落的密度更大、色素更多，同时细菌也容易生长。于这种培养基中加入4.6(m/m)的NaCl，有利于链霉菌生长，但不是所有的链霉菌都能耐受这一浓度的NaCl。M3培养基：选择性分离培养基中较好的一种，这种养分贫乏的培养基阻滞链霉

7、菌的生长，容易分离到其他菌属如红球菌。2、选择合适的pH值大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH通常在6.77.5之间。分离嗜酸放线菌，宜pH4.55.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌，不能在40；、对设备和生产过程的适应性。、遗传稳定性。、产物得率和产物在培养液中的浓度。、产物容易从培养液中回收。投人生产之前须对其产物的毒性和菌种的生产性能做出评价。菌种来源：、自然环境中分离；、从菌种保藏委员会中索取。理想的分离步骤是从土壤环境开始的，土壤中富于各种所需的菌。设计的分离步骤应有利于具有工业重要特性的菌的生长。2.1.3.1 施加选择压力(selective pressure)

8、的分离方法（1）富集液体培养供给特殊培养基或加入某些抑制剂。重复移植几次后，接种少量已富集的培养物到固体培养基上，可将占优势M分离出来。这里，移种的时间是关键，应在所需菌种占优势的情况下移种。连续富集技术： 用连续富集技术分离用于连续发酵生产的菌种特别适合。用连续培养，通过改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率，如图21所示。为了防止连续分离过程中菌体的早期洗出，可采用恒浊器或二级恒化器。用连续富集培养方法可以筛选出能共生的稳定混合培养物，例如用甲烷作碳源筛选到甲烷营养型和一些非甲烷营养型的共生菌。当基质浓度低于时，菌株B将维持比菌株A高的比生长速率；而高于时，菌株A比生长速率较高。因而

9、通过改变稀释速率进行富集培养便能分离到所需要的菌种。用连续富集培养方法可以筛选出能共生的稳定混合培养物。例如用甲烷作为碳源在连续富集培养中筛选到一株含有甲烷营养型的共生菌。甲烷营养型在纯型纯种培养下的生长速率，生产率和培养物的稳定性总是比混合菌差。（2）固体培养基的使用 固体培养基常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有所需的基质，以便促使酶产生菌的生长。有人用这种方法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌属。用不同pH的土壤作为初始种子，分离获得碱性蛋白酶产生菌，其数目与土壤样品的酸碱度有关。一般从碱性土壤中可以收集到众多的产生菌。土壤须经巴氏法消毒，以减少不产孢子的M。然后铺在pH910的琼脂培

10、养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面。根据蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。2.1.3.2 随机分离方法高产培养基成分的选择性准则：有些M的产物对产生菌的筛选没有任何选择性优势可以用来开拓一种新的分离方法。因此常随机地分离所需菌种，并为此发展了一些快速筛选方法和归纳出高产培养基成分的选择性准则如下：、制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素(即C、N、P、O)；、使用一聚合或复合形式的生长限制养分；、避免使用容易同化的碳(葡萄糖)或氮(NH4)，因为它们可能引起分解代谢阻遏；、确定含有所需的辅因子(Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)；、加入缓冲液以减少pH变化。（1）

11、抗生素产生菌筛选在含有试验菌（敏感菌）的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基中，检测抗菌活性。采用联合试验菌。（如枯草杆菌和绿色产色链霉菌可以分离出抗菌活性低、对其他试验菌活性高的新抗生素。因单独用枯草杆菌作试验菌不能检出它们。黄色霉素族的抗生索便是用这类方法找到的。） 用一种很专一的筛选技术可以检出新的抗菌药物。例如：通过鉴定氨卞青霉素与测试样品之间对-内酰胺酶产生菌克雷白氏菌的协同抑制作用，发现了一种-内酰胺酶抑制剂棒酸(Clavulanid acid)。Glaxo公司的研究工作者利用体外酶筛选法筛选羧肽酶的抑制剂，此酶负责细菌细胞壁肽聚糖的交联。（2）药理活性化合物的筛选 筛选能抑制人们

12、代谢某一个关键酶的M产物的原理是一种化合物，例如在体外抑制一关键人体酶，它可以在体内具有药理作用。若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可筛选出新的药理活性化合物。表2-5列出基于酶靶方法的药理筛选例子。（3）生长因子产生菌的筛选 生长因子如AA和核苷酸的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检出产生菌。通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌。大多数AA产生菌属于节杆菌、微细菌、短杆菌、微球菌和棒杆菌属。筛选这类菌时，可在分离培养基中加入抗真菌物如亚胺环己酮。AA产生菌初筛一般在固体培养基上进行。将含有3050个菌落的分离平

13、板影印到能导致AA生产和菌生长的固体培养基上约23d。用UV杀死长好的菌落，然后在其上面铺上一层含营养缺陷型(缺陷所需产物)的菌悬液的琼脂，37C培养16h后，检定菌应在产生菌的周围有一生长圈，这样便可从原来的被影印的平板上分离到所需的产生菌。接着进行液体培养，定量测定其滤液的AA浓度。（4）多糖产生菌的筛选曾从各种环境中分离出多糖产生菌，有人认为制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。从这种环境获得的分离株，可在适当的培养基中生长。并可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。据统计数据表明，应用普通的初筛方法，筛选100000个土壤M(放线菌)，只能发现550个新化合物，并且不能保证从这些新化合物中一

14、定能发现新药或其他有价值的化合物。然而，随着生物技术的发展，分子遗传学和基因工程技术的应用，建立在新型靶位基础上的定靶筛选方法，可大大提高新化合物的发现率。经自然界分离、筛选获得的有价值的菌种，在用于工业生产之前必须经人工选育以得到具一定生产能力的菌种。特别是用于医药上的抗生素，还需通过一系列的安全试验及临床试验，以确定是否是一种有效而安全的新药。第二节 菌种选育菌种选育理论基础：M遗传学、生物化学等。菌种选育目的：获得高产优质生产菌株，发展新品种。经典育种：自然选育和诱变育种定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢调控和基因工程等。2.2.1 自然选育自然选育：利用菌种自然突变(Spo

15、ntaneous Mutation)进行菌种筛选的过程。自然突变：M在没有人工参与下所发生的突变。引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及M自身代谢活动中所产生的一些诱变物质(如H2O2)的作用等。互变异构效应：四种碱基第六位上的酮基和氨基，T和G可以酮式或烯醇式出现，C和A可以氨基或亚氨基形式出现。平衡倾向于酮式和氨基时，DNA双链中以AT和GC碱基对为主。T以烯醇式出现，在DNA复制到达该点的一瞬间，与G配对；C以亚氨基

16、出现时，在新合成的DNA单链的C点出现A可能的自然突变原因。碱基对发生自然突变几率约10-810-9。自然突变两种情况：菌种衰退和生产质量下降；另一种是对生产有益的。为此，生产菌株应定期纯化，保存优良菌种菌株的自然分离。实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落，从中选出稳定菌株用于生产。诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程中往往占优势，因此复试中常常出现产量高低不稳的状态，必须进行自然分离诱变育种和杂交育种必须环节。自然分离（选育）简单易行，效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度的提高。自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。自然选育程序：是把菌种制备成单孢子悬浮液，适当稀释后，在平板上

17、分离，挑取部分单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株。2.2.2 诱变育种2.2.2.1 诱变育种基本原理诱变育种理论基础：基因突变。突变：由于染色体和基因变化而产生的遗传性状变异。突变类型：染色体畸变、基因突变。染色体畸变：染色体或DNA片断缺失、易位、逆位、重复等。基因突变：指DNA分子结构中某一部位发生变化(点突变)。根据突变的发生分自然突变和诱发突变。自然突变：自然条件下出现的基因突变。诱发突变：用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素：物理因素和生物因素、化学因素。诱变处理后，M的遗传物质，DNA和RNA的化学结构发生改变，引起M遗传变异。诱变剂处理使菌

18、种发生突变频率和变异幅度提高获得特性优良变异菌株的几率高。2.2.2.2 诱变育种的一般步骤诱变：由出发菌株开始，制出新鲜孢子悬浮液(或细胞悬液)作诱变处理，然后以一定稀释度涂平皿，至平皿上长出单菌落。诱发突变所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量、使用方法密切关系诱变成功的关键。筛选：将单孢子（细胞）分离长出单菌落后随机挑至斜面；初筛和复筛进行生产能力测定和菌种保存。诱变和筛选不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。考察其稳定性、菌种特性、最适培养条件等后，再中试、放大。2.2.2.3 几个应注意的问题（1）出发菌株出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。（2）复合诱变因

19、素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变，再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可获得高产菌株。乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都用得较普遍，且有一定成效。氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时能促进突变。（3）剂量选择 UV剂量单位：焦耳； X射线剂量单位：库(仑)/kg； 中子剂量单位：戈。 化学诱变剂剂量单位：溶液浓度。 变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。合适剂量：同时

20、增加变异幅度与正突变。（4）变异菌株的筛选诱变目的：高产菌株、新产物。 挑选菌株一般从菌落形态、变异类型着手，发现与产量有关的特性，根据这些特性，分按类挑选一定数量的典型菌株进行发酵和鉴定，确定各种类型与产量间的关系，可大大提高筛选效率。（5）筛选条件得高产菌株的关键在初筛培养基中适当增加淀粉和硫酸铵，可筛到能利用较高浓度糖和氮及效价亦比原菌株略高的产土霉素突变株。用该培养基连续筛选。进一步增加糖、氮，发酵差距更大，代谢慢的菌株，效价更低，对糖、氮利用能力强的菌株，效价更高。诱变育种时应正确处理出发菌株，诱变因素和筛选条件三者的关系。2.2.2.4 常用诱变剂使用方法（1）紫外线(UV) UV

21、诱变最有效波长为253265nm。诱变时一般用菌(孢子)悬浮液进行处理，紫外灯功率15W，距离固定在30cm。紫外线作用机制：主要是形成胸腺嘧啶二聚体改变DNA生物活性，造成菌体变异或死亡。（2）快中子中子是原子核的组成部分、是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电加速器或原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是由质子造成的。受中子照射的物质所射出的质子是不定向的，照射后产生的电离，集中在受照射物体内沿着质子的轨迹上。快中子能量0.210 MeV，较X射线、射线具有较大的电离密度，能更多地引起点突变和染色体畸变。慢中子能量为1

22、/40100eV，效应与 -射线、-射线和电子等基本相同。快中子处理菌（孢子）悬浮液或长在平皿的菌落剂量为l001500戈，诱变效果较好，国内广泛应用。由于剂量测量不统一，国际原子能组织已提倡推广标准化照射装置。（3）氮芥 氮芥是一种极易挥发的油状物。其盐酸盐是白色粉末，一般使用。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠起作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥是用得最早的一种诱变剂，很早就被用于青霉素产生菌选育，效果良好的。诱变机制：引起染色体畸变。氮芥盐酸盐在碳酸氢钠溶液中呈游离状态（氮芥活化），甘氨酸能与氮芥(在碳酸氢钠参与下)结合，形成无毒化合物，因此有解毒作用（氮芥解毒） 。氮芥使

23、用方法：、配制活化剂和解毒剂。称取碳酸氢钠68mg加人蒸馏水10mL活化剂；称取碳酸氢钠136mg，甘氨酸120mg，溶于200mL蒸馏水中解毒剂。高压灭菌备用。、将一只小瓶和橡皮塞灭菌、烘干、称取约10mg氮芥盐酸盐放人瓶中，加入灭菌蒸馏水2mL，成为5mg/mL的氮芥盐酸盐溶液。、吸取1mL孢子悬浮液（200万孢子/mL）于另一灭过菌的小瓶中，加入0.6mL缓冲液，再加入0.4mL上述氮芥溶液，将橡皮塞盖紧，摇匀，此时瓶中氮芥作用浓度为1mg/mL。、加入氮芥溶液30s后开始计算时间，达到所需要时间后，用1mL注射器吸取0.1mL处理液加到9.9mL解毒剂中，氮芥作用停止。（4）亚硝酸亚硝

24、酸诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。A、C、G分别被脱去氨基而成为次黄嘌呤（H）、尿嘧啶(U)、黄嘌呤(X)，复制时，分别与C、A、C配对。前两种情况可引起碱基对转换而造成突变。由A：TGMC，GMCA：T的转换已经得到证实。X(黄嘌呤)只能与C配对，不能与T配对，不能引起GMCA：T转换，不会造成突变。亚硝酸还会引起DNA两条链间交联而造成DNA结构上的缺失，但对其机制还不太清楚。亚硝酸不稳定，容易分解成水和硝酸酐（2HNO2N2O3+H2O），硝酸酐继续分解放出NO和NO2（N2O3NO+NO2）。所以，临用前将亚硝酸钠放在pH4.5醋酸缓冲液中，生成亚硝酸（NaNO2+H+HNO2+Na+

25、）后再用。（5）N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍（NTG）亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到1280的营养缺陷型菌株，有超诱变剂之称。pH55.5：形成HNO2引起菌种突变；碱性：重氮甲烷形式对DNA起烷化作用；pH=6：两者均不产生，诱变效应可能是由于NTG本身对核蛋白体引起的变化所致。NTG在缓冲液中较难溶解，而甲酰胺中溶解度较大，用甲酰胺溶解NTG，可提高处理浓度。用300g/mL NTG 、28oC处理60min，易得到高产菌株。（6）航天育种航天育种：利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线辐射的作用下，使生物的遗传性状发生变异，

26、从而选育出优良菌种。利用返地卫星或高空气球搭载植物种子进行航天育种，已获得满意结果。利用航天育种技术进行M遗传育种国内尚处起步阶段。1996年以来，国防科工委863-2办公室相继组织了返地卫星和高空气球搭载M、动物细胞和植物种子，为M诱变育种提供了新手段。2.2.3 抗噬菌体菌株的选育2.2.3.1 噬菌体的分布噬菌体广泛存在于土壤、肥料、粪便和污水中。有寄主细胞的地方，易找到其噬菌体。病人外科疮口脓液中易找到金黄色葡萄球菌噬菌体；受细菌病害植株上可分离到噬菌体。细菌发酵工厂排出的菌体如不及时处理，便有可能在下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌体，情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体。2.2.

27、3.2 抗噬菌体菌株的选育工业M发酵过程中，不少生产菌种遭受烈性噬菌体的感染，使生产不能进行。出现噬菌体后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。噬菌体很易发生变异，又会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行波动试验、涂布试验和影印培养等试验结果指出，细菌的抗性是基因突变的结果，抗噬菌体突变和噬菌体的存在与否无关。（1）抗噬菌体菌株选育方法a 自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株孢子自然突变为抗性菌株得抗性突变频率低。b 诱发突变诱变处理过的敏感菌株孢子液分离在高浓度噬菌体平板上，长出的菌落为抗性变异株生

28、长速度一般与正常菌落相近，诱变可提高抗性菌株的频率。诱变后敏感菌孢子接入种子培养基，菌丝长浓后加入高浓度噬菌体再培养几天，加入噬菌体反复感染，敏感菌裂解，平板分离抗性株。（2）抗噬菌体菌株的特性试验a 抗噬菌体性状稳定性试验抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。还可观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。b 抗性菌株产量试验抗噬菌体菌株生产能力不低于原敏感株。一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发酵特性方面会有些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通气量、无机磷添加量及其他培养条件的要求等。c 抗性与溶源性的区别试验菌株的抗噬菌体特性具有相对遗传稳定性，抗性表现：改变细胞壁结构阻止噬菌体吸附侵入，改变生理代谢使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放，这些菌株具有真正的抗性。溶源性菌株不是真正抗性菌。2.2.3.3 噬菌体的防治 感染噬菌体后会出现畸形菌丝，菌体迅速消失，pH值上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。 链霉素、红霉素、万古霉素、金霉素、林可霉素、谷氨酸、丙酮丁醇、山梨糖、碱性蛋白酶发酵过程中都会遭到噬菌体侵染。（1）正确判断 根据发酵中出现的异常现象，进行客观的联系分析，及时做出正确的判断。（2）普及有关噬菌体知识 使从事种子制备、无菌试验的人员知道什么叫