1、NGS实验室建设标准与要求规范NGS实验室建设标准与要求一、高通量测序( NGS)实验室简介1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。 NGS是下一代测序技术 ( NEXT GENERATIONS EQUENCIN)G即高通量测序技术的简称。高通量测序技术是对传 统 SANGER测序(称为一代测序技术)革命性的改变 , 可同时对几十万到 几百万条核酸分子进行序列测定, 同时高通量测序使得对一个物种的转 录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能 , 也称为深度测序 (DEEP SEQUENCIN)G。1.2由于 NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增, 容易出现实验室污染 导致检测结果准确性下
2、降;另外 NGS技术要求高、影响因素多,实验过 程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。 因此临床基因扩增 检验实验室技术验收和规范化管理是 NGS技术本身需要, 也是在临床上 顺利应用该技术前提。二、NGS实验室临床应用的基本条件2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准 NGS实验室。2.2检测设备必须符合标准 NGS实验室设置要求: 高通量测序仪及配套服务 器;高通量测序检测试剂盒;通用电脑;自动分析软件,实验室样本信 息管理系统等。2.3检测人员必须通过专门的技能培训, 并获得省级以上卫生计生行政部门 颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。 NGS实验室必须建立严格的实 验室管理制度
3、、建立标准化操作程序( SOP)、建立系列质量管理文件 等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、 确保实验室卫生安全,确保实验室长期稳定运行。2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。三、NGS实验室建设基本要求3.1主体结构 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金 50 内圆角 铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固,线条简明,美 观大方,密封性好。3.2标准的各区分隔和气压调节将检测过程分成试剂准备、样本制备、 PCR扩增和高通量测序四个独立的实 验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区, 同 时各区通过气压
4、调节, 使整个检测实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染 并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区和 PCR扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇 门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。3.3消毒在每个实验区和缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。在各 区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。3.4机械连锁不锈钢传递窗试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递, 保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。3.5地面地面建议使用 PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。便于进行清扫,耐腐 蚀。没有条件的也可采用水磨石地面,或大
5、块的瓷砖(至少 800MM800MM)接缝需要小于 2MM。3.6照明灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。3.7平面布局NGS实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定 分区的多少及各区域的空间大小, 至少具体需要多少个区, 同样是“个体化” 的,以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”作为基本原则。四、各项目实验室建设标准产前筛查与产前诊断(全基因组低拷贝测序技术)1. 实验室平面图图 1 :产前筛查与诊断实验室平面图2.技术流程图图 2 :产前筛查与诊断技术流程图3.技术参数分区压力温度相对湿度照明专用走廊0Pa20-2540%60%主实验室 300L
6、X,其余房间 200300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+15Pa标本与文库制 备区+10Pa文库扩增与检 测区-5Pa测序区-10Pa4.分区功能4.1试剂准备室主要功能:在 NGS过程中使用到的试剂的配制、分装和保存。4.2标本与文库制备区主要功能:血液处理、血浆制备、 DNA提取、 DNA片段化、 DNA样品的纯化、 DNA浓度检测、末端修复、接头连接、构建样本的测序文库。4.3文库扩增与检测区主要功能:文库构建后的 PCR扩增与纯化、文库浓度检测、文库的混合及混 合后的质检分析。4.4测序区主要功能:测序模板制备(乳液 PCR与磁珠富集回收)、上机测序、数据分 析、报告审核及发放。5.仪
7、器配置5.1试剂准备室主要仪器设备:加样器、冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、 移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2标本与文库制备区主要仪器设备:冷冻离心机、微量台式离心机、掌上三管离心机、涡旋震荡 器、垂直混合仪、移液器、可移动紫外灯、生物安全柜、冰箱、托盘天平、 Qubit 2.0 核酸定量仪、电脑(可连接互联网)、条形码打印机、普通打印 机、扫描枪、磁力架等。5.3文库扩增与检测区主要仪器设备: PCR仪、 QPCR仪、Qubit2.0 核酸定量仪、可移动紫外灯、超 净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、 UPS、冰箱、移液器、磁 力架等。5.4测序区主要仪器设备:
8、高通量测序仪、 PC电脑、打印机、 UPS、恒温金属浴、纯水 仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动紫 外灯、磁力架、 PCR仪等。胚胎植入前遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)1. 实验室平面图图 3: PGD实验室平面图2. 技术流程图图 4: PGD技术流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明专用走廊0Pa20-2540%60%主实验室 300LX,其余 房间 200300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+15PaWGA制备室+10pa扩增一区-5pa标本检测区-10Pa测序区-15Pa电泳区0Pa4. 分区功能4.1试剂准备室主要功能:在 NGS过程中使用到的试剂
9、的配制、分装和保存。4.2WGA制备区主要功能:基因组 DNA释放、全基因组 DNA扩增。4.3电泳区主要功能: DNA电泳检测及结果反馈、 DNA打断等4.4扩增一区主要功能: DNA片段的末端修复与纯化、接头连接与纯化、文库混合、缺口 平移。4.5文库检测区主要功能:文库浓度质检分析。4.6测序区主要功能:测序模板制备(乳液 PCR与磁珠富集回收)、上机测序、数据分 析、报告审核及发放。5. 仪器配置5.1试剂准备区主要仪器设备:冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、 可移动紫外灯和超净工作台等。5.2电泳区主要仪器设备:电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振
10、荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.3WGA制备区主要仪器设备: PCR仪、超净工作台、冰箱、掌式离心机、涡旋振荡器、移 液器、可移动紫外灯等。5.4扩增一区 主要仪器设备: PCR仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心 机、涡旋振荡器、 UPS、移液器、磁力架等。5.5文库检测区主要仪器设备: QPCR仪、 Qubit2.0 核酸定量仪、可移动紫外灯、超净工作 台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、移液器等。5.6测序区主要仪器设备:高通量测序仪、 PC电脑、打印机、 UPS、恒温金属浴、纯水 仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工作台、可移动紫 外灯、磁力架、
11、PCR仪等。遗传病诊断 +肿瘤诊断与治疗(杂交捕获测序技术 +SANGER测序验证)1. 实验室平面图图 5 :肿瘤诊断实验室平面图2. 技术流程图图 6 :肿瘤诊断技术流程图图 7 :一代测序实验流程图3. 技术参数分区压力温度相对湿度照明洁净走廊0Pa20- 2540%60%主实验室 300LX,其余 房间 200 300LX缓冲区+5Pa试剂准备室+15Pa标本与文库制备区+10PaDNA打断区+10Pa杂交捕获区(扩增一区)-5Pa文库扩增区(扩增二区)-10Pa文库检测区-10Pa测序区-15Pa电泳区0 Pa4. 分区功能4.1试剂准备区主要功能:在 NGS过程中使用到的试剂的配制
12、、分装和保存。4.2标本与文库制备区主要功能:样本接收、样本前处理、全基因组 DNA提取以及各种样本 DNA或 者 RNA的提取、 DNA片段化、 DNA纯化、 DNA浓度测定、 DNA片段的末端修复 与纯化、接头连接与纯化。4.3DNA打断区主要功能: DNA打断(片段化)。4.4电泳区主要功能: 片段化 DNA电泳检测及结果反馈。4.5杂交捕获区(扩增一区)主要功能:目的 DNA片段的杂交捕获与纯化, Sanger 测序目的片段扩增与纯 化、 Sanger 测序 PCR前准备。4.6文库扩增区(扩增二区)主要功能:杂交捕获后扩增与纯化、文库浓度质检分析、及 Sanger 测序的 PCR扩增
13、反应与纯化。4.7测序区主要功能:测序模板制备(乳液 PCR与磁珠富集回收) 、上机测序、及 Sanger 测序。5. 仪器配置5.1试剂准备区主要仪器设备:加样器、冰箱、分析天平、微量台式离心机、涡旋振荡器、 移液器、可移动紫外灯和超净工作台等。5.2标本与文库制备区 主要仪器设备:微量台式离心机、掌上三管离心机、恒温金属浴、移液器、 可移动紫外灯、生物安全柜、冰箱、托盘天平、 Qubit 2.0 核酸定量仪、 PCR 仪、电脑(可连接互联网)、条形码打印机、普通打印机、扫描枪等。5.3DNA打断区 主要仪器设备: Covaris S220超声波打断仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振荡 器、移液器
14、、可移动紫外灯等。5.4电泳区主要仪器设备:电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冰箱、掌式离心机、涡旋振 荡器、移液器、可移动紫外灯等。5.5杂交捕获区(扩增一区)主要仪器设备:PCR仪、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器等。5.6文库扩增区(扩增二区)主要仪器设备:PCR仪、 Qubit 2.0 核酸定量仪、微量台式离心机、掌上三管离心机、涡旋震荡器、移液器、可移动紫外灯、超净工作台、冰箱、磁力 架等。5.7测序区主要仪器设备:高通量测序仪、 Sanger 测序仪、 PC电脑、打印机、 UPS、恒 温金属浴、纯水仪、冰箱、微量台式离心机、涡旋振荡器、移液器、超净工 作台、可移动紫外灯、磁力架、 PCR仪等。
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